復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵法提高甜高粱秸稈飼料品質(zhì)的研究

■岳 麗 王 卉 山其米克 茆 軍 涂振東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆烏魯木齊830091)

甜高粱是一種多用途飼料作物，具有耐旱、耐 澇、耐鹽堿、耐瘠薄等優(yōu)良特性[1-2]。甜高粱的籽粒和莖稈都可用于生產(chǎn)燃料乙醇，因此被視為最有希望的能源作物[3]。甜高粱秸稈制備乙醇后的剩余殘?jiān)腥院胁糠种?、蛋白質(zhì)、粗纖維等碳水化合物，可用于制作飼料[4]。甜高粱莖稈殘?jiān)闹饕煞譃槟举|(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于分解[5]。添加纖維素酶可降解部分纖維素，但是纖維素酶生產(chǎn)成本高，不適合大規(guī)模使用[6]，通過(guò)菌株自身酶系來(lái)降解木質(zhì)纖維素是降低發(fā)酵成本的重要手段之一[7]。目前多采用霉菌作為降解纖維菌種，如綠色木霉、康寧木霉、黑曲霉、青霉等[8]。研究表明，利用單菌或單酶對(duì)未經(jīng)處理的木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解十分困難[9]。因此，如果要充分降解纖維素，需考慮多種微生物之間的協(xié)同作用。焦有宙等研究了一種高效的玉米秸稈降解復(fù)合菌，發(fā)酵后半纖維素的降解率最高達(dá)到48.53%，纖維素的降解率為 36.38%，木質(zhì)素的降解率為40.11%[10]。李明軒以稻草為底物，利用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混菌發(fā)酵，發(fā)酵最終產(chǎn)物中粗蛋白含量從3.49%增加到16.59%，粗纖維含量從44.56%下降到23.17%[11]。通過(guò)微生物發(fā)酵的手段將甜高粱秸稈轉(zhuǎn)變成蛋白飼料，不僅節(jié)約資源，還有利于農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但由于微生物間存在著協(xié)同、拮抗等復(fù)雜的關(guān)系，因此目前研究的重點(diǎn)是不同種屬菌種間的配伍能否發(fā)揮正協(xié)同作用[12]。本研究以甜高粱秸稈酒糟為主要原料，以黑曲霉等菌種為發(fā)酵菌種，以提高甜高粱秸稈發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)含量，降低粗纖維含量為目標(biāo)，探索單一菌種及雙菌組合對(duì)甜高粱秸稈發(fā)酵飼料中各物質(zhì)含量的影響，為發(fā)酵甜高粱秸稈生產(chǎn)蛋白飼料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基：新高粱3號(hào)酒糟，為新高粱3號(hào)秸稈發(fā)酵蒸餾乙醇后殘?jiān)?；麩皮?gòu)于北園春市場(chǎng)。白地霉(B)、康寧木霉(K)、產(chǎn)朊假絲酵母(R)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉(H)、枯草芽孢桿菌(C)為本所在實(shí)驗(yàn)室保存。供試菌種所用培養(yǎng)基及主要作用見(jiàn)表1。

表1 供試菌種所用培養(yǎng)基及主要作用

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

用無(wú)菌吸管吸取0.5 ml的液體培養(yǎng)基于安瓿管中將干燥菌體全部溶解，吸出至含有 4～5 ml液體培養(yǎng)基的試管中，白地霉用麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5 d?？祵幠久褂民R鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d?？莶菅挎邨U菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d。

1.2.2 液體菌種制備

將100 ml液體培養(yǎng)基裝入500 ml三角瓶中，接入活化的菌種兩環(huán)，28℃、120 r/min水浴搖床培養(yǎng)24 h備用。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

稱取100 g甜高粱秸稈酒糟裝入三角瓶中，121℃滅菌20 min后，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵培養(yǎng)基重的10%（V/W）接入菌種，滅菌后28℃培養(yǎng)72 h，經(jīng)65℃烘干、粉碎后供分析測(cè)定用。

1.2.4 菌種組合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雙菌（接種比例1∶1）混合發(fā)酵，見(jiàn)表2，每個(gè)組合設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表2 雙菌組合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 粗纖維含量測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T6434—94酸堿洗滌法測(cè)定粗纖維含量。

1.4 單菌種發(fā)酵

選取5株菌種，在無(wú)菌操作的條件下，向發(fā)酵基質(zhì)中按10%（v/w）接種量接入菌種菌懸液，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?30±1)℃的條件下，發(fā)酵 3 d后，在60℃條件下將發(fā)酵產(chǎn)物烘干、粉碎，測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量和粗纖維含量。每個(gè)處理做3次重復(fù)，對(duì)照試驗(yàn)為未接菌的甜高粱秸稈酒糟。

1.5 雙菌種發(fā)酵

依據(jù)單菌發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果，篩選出4株菌種，將這4株菌種兩兩組合進(jìn)行混菌發(fā)酵試驗(yàn)，菌種配比為1∶1，從而確定出適宜的雙菌組合配伍，其余操作同1.4節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 單一菌種發(fā)酵試驗(yàn)

不同菌種對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的分解利用程度不同。根據(jù)不同菌種發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)及粗纖維含量，從而篩選出分解利用甜高粱秸稈基質(zhì)較好的菌種，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同菌種對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響

由圖1a可看出，與未接菌的甜高粱秸稈酒糟相比較，白地霉、黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量顯著性增加（P＜0.05），增加幅度可達(dá)75.32%、65.11%和37.11%，而且增加幅度比其余2株菌株大，這是由于黑曲霉在生長(zhǎng)和繁殖的過(guò)程當(dāng)中，會(huì)分泌出纖維素酶、果膠酶以及淀粉酶等[13]，這些酶類(lèi)可以降解甜高粱秸稈發(fā)酵基質(zhì)中的纖維素等，將其轉(zhuǎn)化為小分子的單糖，為微生物生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)物中菌體蛋白積累；而白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量也顯著性升高（P＜0.05），其含量可分別達(dá)18.94%、14.81%，這是由于其自身菌體具有較高的蛋白質(zhì)含量[14]。

由圖1b可以看出，產(chǎn)朊假絲酵母、黑曲霉、康寧木霉、白地霉、枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量較空白組差異顯著(P＜0.05)，且康寧木霉、枯草芽孢桿菌降低粗纖維幅度較大，分別降低了36.9%、30.98%，這是因?yàn)榭祵幠久箷?huì)分泌一些纖維素酶和半纖維素酶，分解了部分纖維素[15]。

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

從圖2可看出，在發(fā)酵時(shí)間1～9 d內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，粗纖維含量呈下降趨勢(shì)，在9 d時(shí)達(dá)到最低值34.24%；蛋白質(zhì)含量呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，平均值可達(dá)到19.69%。與發(fā)酵7 d相比，發(fā)酵9 d時(shí)蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于部分蛋白質(zhì)分解造成的。綜合考慮蛋白質(zhì)含量和粗纖維含量，發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)品質(zhì)較好。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白地霉發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，白地霉發(fā)酵秸稈酒糟殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量顯著升高（P＜0.05），這可能是由于白地霉利用發(fā)酵基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)成分增殖菌體引起的[16]。粗纖維含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，這可能是由于白地霉可以合成纖維素酶，降解部分纖維素，引起產(chǎn)物中粗纖維含量逐漸降低。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白地霉發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母酒糟品質(zhì)的影響

由不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量和蛋白質(zhì)含量變化曲線（見(jiàn)圖4）可以看出：產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量在7 d時(shí)達(dá)到高峰12.73%，隨后逐漸下降，可推斷產(chǎn)朊假絲酵母在7 d時(shí)蛋白酶活力最大。粗纖維含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌酒糟品質(zhì)的影響

從圖5可以看出，枯草芽孢桿菌發(fā)酵9 d后粗纖維降解率明顯高于3 d。從曲線也看出，枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理第7 d至第9 d時(shí)蛋白質(zhì)含量急劇增加，從14.84%增加到16.59%，相對(duì)增加了11.7%。粗纖維含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)康寧木霉酒糟品質(zhì)的影響

從不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量及粗纖維含量的變化情況可以看出(見(jiàn)圖6)，經(jīng)康寧木霉發(fā)酵后的甜高粱秸稈酒糟，蛋白質(zhì)含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，第7 d時(shí)蛋白質(zhì)含量最高。從發(fā)酵第3 d到第9 d，康寧木霉處理后秸稈酒糟中的粗纖維含量呈直線下降趨勢(shì)。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)康寧木霉發(fā)酵酒糟品質(zhì)的影響

2.2 雙菌組合發(fā)酵結(jié)果

將不同的微生物進(jìn)行組合后，不同的組合利用甜高粱秸稈基質(zhì)的效果將會(huì)產(chǎn)生差別，因?yàn)樗鼈兊幕プ鳈C(jī)制不同，從而導(dǎo)致協(xié)同關(guān)系有差異[17-18]，所以需要測(cè)定不同的雙菌組合發(fā)酵秸稈酒糟中蛋白質(zhì)含量和粗纖維含量，從而篩選出最優(yōu)組合，結(jié)果如圖7所示。

圖7 雙菌組合對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響

由圖7可看出，與空白組相比，6個(gè)雙菌組合的秸稈酒糟發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量均顯著性升高（P＜0.05），粗纖維含量顯著性降低（P＜0.05），同時(shí)，與相對(duì)應(yīng)的單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物相比較，雙菌組合發(fā)酵秸稈酒糟中的粗蛋白質(zhì)含量均比之高，粗纖維含量均比之低。6種菌種組合中，白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母組合，蛋白質(zhì)含量增加幅度最大，與空白組相比增加了19.43%，但是此組合粗纖維含量高達(dá)38.95%。黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母組合發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量為18.79%，與白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母組合相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；粗纖維含量為34.68%，較未接菌降低了16.38%，且較單一菌種黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母分別降低了8.15%、7.01%；綜合考慮發(fā)酵后甜高粱秸稈酒糟中的蛋白質(zhì)含量和粗纖維含量，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母組合協(xié)同共生關(guān)系最優(yōu)。

3 討論

將酵母菌與木霉、黑曲霉或白地霉進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)，雙菌組合的粗蛋白含量均高于相應(yīng)單一菌種。這可能是由于混菌之間可以形成良好的協(xié)同共生關(guān)系[19-20]，且對(duì)合成蛋白酶和纖維素酶的過(guò)程具有一定的反饋調(diào)節(jié)作用，大大增加蛋白酶和纖維素酶的活力[21-22]。同時(shí)，分泌的纖維素酶可促進(jìn)甜高粱秸稈基質(zhì)中纖維素分解為單糖，促進(jìn)菌種生長(zhǎng)繁殖，增加菌體蛋白，從而提高發(fā)酵秸稈酒糟中粗蛋白質(zhì)含量，降低纖維素含量。

4 結(jié)論

①在單一菌種發(fā)酵試驗(yàn)中，得出可用于提高發(fā)酵高粱秸稈酒糟蛋白質(zhì)含量的優(yōu)良菌種為白地霉，分解粗纖維的優(yōu)勢(shì)菌種為康寧木霉。

②在雙菌組合發(fā)酵試驗(yàn)中，綜合考慮蛋白質(zhì)含量和粗纖維含量，可得出黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母是用于發(fā)酵甜高粱秸稈酒糟蛋白飼料的優(yōu)選組合，發(fā)酵7 d后，粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)18.79%，粗纖維含量34.68%。