Notch信號(hào)通路在胰腺癌中的表達(dá)及其作用研究

羅 干 易 超 依馬木買(mǎi)買(mǎi)提江·阿布拉 徐 林 尹繼煒 丁 偉

2018年美國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌的5年生存率僅為8%，在所有癌癥相關(guān)死亡中居第4位[1]。目前多數(shù)研究證實(shí)胰腺癌惡性生物學(xué)特性的產(chǎn)生與維持是一個(gè)多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的過(guò)程[2-4]。本研究采用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片分析胰腺癌組織及其癌旁組織中Notch信號(hào)通路成員的差異表達(dá)情況，并通過(guò)阻遏差異表達(dá)最為顯著的基因，研究Notch信號(hào)通路在胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本和質(zhì)量控制

組織樣本：收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院2014年1月—2016年6月行胰十二指腸切除術(shù)，術(shù)后病理確診為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的新鮮癌組織及癌旁組織標(biāo)本10例。所有患者均為我院首次確診的新發(fā)病例未合并其他惡性腫瘤或高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾??；術(shù)前未行放、化及抗腫瘤等相關(guān)治療，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)局部脈管侵犯、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；患者本人及患者家屬同意留取組織標(biāo)本并用于研究，允許研究資料交流發(fā)表。組織樣本收集嚴(yán)格按照美國(guó)IRB和HIPAA批準(zhǔn)方案進(jìn)行。

質(zhì)量控制：組織樣本采用Trizol試劑盒提取并純化獲得總RNA后用Nanodrop 2000與Agilent 2100儀器進(jìn)行質(zhì)檢，參照Unger等[5]方法，篩選出滿足(1)RIN值≥7.0；(2)28S/18S>0.7且1.7

1.2 應(yīng)用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片分析胰腺癌組織及其癌旁組織中的Notch信號(hào)通路成員表達(dá)差異情況

經(jīng)檢測(cè)合格樣本的總RNA參照Villegas-Ruiz等[6]方法由上海吉?jiǎng)P基因代為行基因表達(dá)譜芯片分析，反應(yīng)程序見(jiàn)表1；獲得基因表達(dá)譜芯片分析數(shù)據(jù)后通過(guò)對(duì)比KEGG和BioCarta數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Fisher精確檢驗(yàn)分析并計(jì)算Notch信號(hào)通路中包含的差異表達(dá)基因的富集度水平，篩選出該信號(hào)通路中表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因；依據(jù)Primer Bank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的PCR引物信息合成表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Notch信號(hào)通路成員引物(表2)，以GAPDH為內(nèi)參照，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)胰腺癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因表達(dá)量(目的基因表達(dá)量/內(nèi)參基因表達(dá)量)，以癌旁組織目的基因表達(dá)量做為參照，計(jì)算各樣本目的基因相對(duì)表達(dá)量；提取組織樣本總蛋白采用Western blot法檢測(cè)各組樣本成員蛋白表達(dá)情況，利用Image J軟件分析并計(jì)算各組樣本目的蛋白相較于癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 胰腺癌原代細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)

按照徐林等[7]研究方法，采用胰腺癌組織源細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒(Human Cancer PrimaCellTM：Pancreatic Cancer Tissues Cells)在符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的新鮮胰腺癌組織樣本中分離并純化獲得胰腺癌原代細(xì)胞，完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗)、37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%及以上面積時(shí)按1∶2比例傳3代。

1.4 人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

依據(jù)GenBank提供的基因信息設(shè)計(jì)并篩選出3條JAG2 siRNA片段(表3)，參照張波等[8]研究方法構(gòu)建攜帶3條JAG2 siRNA片段的慢病毒表達(dá)載體，并按照吉?jiǎng)P轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染胰腺癌原代細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為10，感染條件為Eni.S+polybrene，病毒量：siRNA1 2 μL、siRNA2 1.5 μL、siRNA3 2 μL)，感染后按1∶2傳3代培養(yǎng)；以GAPDH為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot法檢測(cè)3組細(xì)胞中JAG2基因mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量，選擇JAG2表達(dá)阻遏效果最好的細(xì)胞株用于后續(xù)研究。

表1 Affymetrix基因表達(dá)譜芯片分析反應(yīng)程序

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.5 人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株生物學(xué)特性分析

上述未經(jīng)轉(zhuǎn)染的胰腺癌原代細(xì)胞加入轉(zhuǎn)染試劑作為對(duì)照組，構(gòu)建的JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，行如下研究：(1)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：參照MTT試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)每天的OD490值，并以測(cè)得的d1、d2、d3、d4、d5 OD490值與d1 OD490的比值作為標(biāo)準(zhǔn)OD490值(OD490/fold表示各天的增殖倍數(shù))繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)比兩組細(xì)胞增殖情況差異；(2)細(xì)胞周期分析：兩組細(xì)胞分別加入含碘化丙啶(PI)細(xì)胞染色液染色后，采用流式細(xì)胞儀分析兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期，對(duì)比兩組細(xì)胞細(xì)胞周期差異；(3)細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：參照侵襲小室試劑盒說(shuō)明，上室中分別加入500 μL兩組細(xì)胞懸液并調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)，下室內(nèi)加入750 μL 30%FBS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基及非轉(zhuǎn)移細(xì)胞后Giemsa染色3～5 min，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞，對(duì)比分析兩組細(xì)胞侵襲能力差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 Affymetrix基因表達(dá)譜芯片篩選基因表達(dá)差異情況

在胰腺癌組織及其癌旁組織標(biāo)本間共檢測(cè)基因38079對(duì)，依據(jù)KEGG和BioCarta數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出差異表達(dá)基因512個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因419個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因93個(gè)。通過(guò)對(duì)比信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)信息，Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵成員NOTCH1、NOTCH2、JAG2、HES1基因在癌組織中均存在不同程度的上調(diào)表達(dá)(表4)。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和Western blot檢測(cè)結(jié)果

胰腺癌組織中NOTCH1、NOTCH2、JAG2、HES1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1-3)，Western blot結(jié)果顯示蛋白表達(dá)情況與實(shí)時(shí)定量PCR基本一致。

表4 胰腺癌組織及其癌旁組織間Notch信號(hào)通路差異表達(dá)基因

圖1 胰腺癌組織及其癌旁組織間Notch信號(hào)通路中基因mRNA相對(duì)表達(dá)量示意圖Figure 1 Relative expression of NOTCH1，NOTCH2，JAG2 and HES1 mRNA in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues

圖2 Notch信號(hào)通路中蛋白在各組細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量示意圖Figure 2 The expression levels of NOTCH1，NOTCH2，JAG2 and HES1 proteins in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues

圖3 Notch信號(hào)通路中各蛋白在X光顯影照片F(xiàn)igure 3 The expression levels of NOTCH1，NOTCH2，JAG2 and HES1 proteins in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues by X-ray film

2.3 人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

本研究通過(guò)Affymetrix基因表達(dá)譜芯片篩選出JAG2基因表達(dá)差異最大(上調(diào)表達(dá)8.20倍)，故將JAG2基因作為阻遏的靶向基因。圖4為構(gòu)建的3條JAG2 siRNA慢病毒質(zhì)粒PCR菌檢電泳照片，陽(yáng)性克隆提抽質(zhì)粒后測(cè)序結(jié)果證實(shí)合成的siRNA片段與設(shè)計(jì)相符且插入載體順序正確，無(wú)堿基錯(cuò)排或點(diǎn)突變；經(jīng)熒光法測(cè)得3種siRNA慢病毒載體滴度分別為6×108、8×108及5×108TU/mL。圖5為構(gòu)建的3株人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞中JAG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，圖6為3株細(xì)胞JAG2蛋白Westen blot檢測(cè)顯影照片，檢測(cè)結(jié)果顯示，3株細(xì)胞JAG2基因表達(dá)抑制率分別為69.2%、4.8%、60.5%，故選擇第1株細(xì)胞用于后續(xù)研究。

2.4 人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株生物學(xué)特性分析

2.4.1 細(xì)胞增殖檢測(cè) 對(duì)照組第1、2、3、4、5天OD490/fold值分別(1.00±0.01)、(1.41±0.02)、(1.86±0.03)、(2.25±0.09)、(3.22±0.03)；實(shí)驗(yàn)組分別為(1.00±0.02)、(1.17±0.01)、(1.23±0.05)、(1.52±0.02)、(2.01±0.08)。MTT檢測(cè)結(jié)果表明相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)OD490值第4、5天存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)構(gòu)建的人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制(圖7)。

2.4.2 細(xì)胞周期分析 培養(yǎng)5天后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，對(duì)照組中細(xì)胞處于G1期、S 期及G2/M 期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例分別為(55.05±1.23)% 、(23.53±0.94)% 、(21.42±0.82)%；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各期細(xì)胞比例則分別為(61.06±0.80)% 、(11.88±1.03)% 、(27.07±0.39)%(圖8)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組處于S期、G1期、G2/M期的細(xì)胞百分比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可得出實(shí)驗(yàn)組的胰腺癌細(xì)胞位于G1及G2/M期的細(xì)胞增多，而位于S期的細(xì)胞則明顯減少(P<0.05)。

圖4 JAG2 siRNA慢病毒表達(dá)載體PCR菌檢電泳照片F(xiàn)igure 4 Electrophoresis of PCR products of JAG2 siRNA lentiviral expression vectorsNote：Stripe 1 was the blank control group added with ddH2O；Stripe 2 was the control group that added blank lentivirus vector；Stripe 3 was the Maker for 5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp and 100 bp from top to bottom；and Stripes 4 to 8 for siRNA lentiviral Vectors.

圖5 構(gòu)建的人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2 基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株中JAG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 5 The relative expression of JAG2 mRNA in JAG2 repressor expression human pancreatic cancer cells

圖6 構(gòu)建的人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2 基因阻遏表達(dá)細(xì)胞株中JAG2蛋白Western blot檢測(cè)顯影照片F(xiàn)igure 6 The expression of JAG2 protein in human pancreatic cancer primary cells

2.4.3 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組小室下室內(nèi)的細(xì)胞計(jì)數(shù)為(3.0±1.00)個(gè)/高倍視野；對(duì)照組為(63±2.51)個(gè)/高倍視野。證實(shí)構(gòu)建人胰腺癌原代細(xì)胞JAG2基因阻遏表達(dá)細(xì)胞侵襲遷移能力顯著下降(P<0.05)(圖9)。

圖7 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure 7 Cell curves of pancreatic cancer primary and JAG2 gene repression-expressing cells

圖8 各組細(xì)胞周期比率Figure 8 The distribution of cell cycle in pancreatic cancer primary and JAG2 gene repression-expressing cells

圖9 各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力測(cè)定Figure 9 Invasive and metastatic capacity of pancreatic cancer primary and JAG2 gene repression-expressing cellsNote：A.The pictures of invasion chamber in the control and experimental groups(200×)；B.The number of migration cells between pancreatic cancer primary and JAG2 gene repression-expressing cells.

3 討論

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Notch信號(hào)通路能夠直接發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和分化的作用，也可以通過(guò)影響機(jī)體其他信號(hào)通路間接或者共同調(diào)控機(jī)體生物學(xué)功能[9]。近年來(lái)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的逐步成熟給我們分析疾病發(fā)展的過(guò)程提供了新的檢測(cè)方式，本研究中所采用的Affymetrix基因表達(dá)譜芯片，因其包含目前更為準(zhǔn)確、靈敏且可信度更高的人類(lèi)全基因組信息和cDNA，所以是目前應(yīng)用最為廣泛的基因表達(dá)譜芯片之一[10]。本研究通過(guò)Affymetrix基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除后胰腺癌組織及其癌旁組織Notch信號(hào)通路成員中NOTCH1、NOTCH2、JAG2及其下游靶基因HES1表達(dá)均有明顯差異。其中JAG2上調(diào)表達(dá)8.20倍，且JAG2作為Notch信號(hào)通路的配體已被證實(shí)與胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-13]。但目前在胰腺癌方面的報(bào)道還不多，通過(guò)文獻(xiàn)檢索示JAG2基因高表達(dá)會(huì)影響胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，但這種作用的發(fā)揮并不是由JAG2獨(dú)立完成，而是要與Notch1相互作用[14]。

目前siRNA病毒載體轉(zhuǎn)染因其制備方便、價(jià)格低廉、高度的特異性及高效性等優(yōu)點(diǎn)從而成為研究信號(hào)通路的主要方法之一[15-16]。為了進(jìn)一步研究JAG2基因和Notch信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及機(jī)制，本研究成功構(gòu)建了JAG2基因阻遏表達(dá)的胰腺癌原代細(xì)胞株，分析阻遏表達(dá)細(xì)胞株生物學(xué)特性顯示其細(xì)胞株的生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程均被明顯抑制。本研究結(jié)果表明JAG2基因可調(diào)控胰腺癌的Notch信號(hào)通路，同時(shí)也提示Notch信號(hào)通路可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

綜上所述，盡管Notch信號(hào)通路與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但因可行手術(shù)治療的胰腺癌患者較少及胰腺癌原代細(xì)胞難以分離和培養(yǎng)，導(dǎo)致樣本量較少，結(jié)果存在一定的偏差。筆者認(rèn)為，隨著分子生物學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，Notch信號(hào)通路參與胰腺癌具體機(jī)制定將得到充分闡明，并可作為治療的重要靶點(diǎn)，從而為胰腺癌診治提供新的思路，將有助于胰腺癌的早期預(yù)防、早期診治及研制靶向藥物。