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    不同類型子癇前期孕婦血清及胎盤組織中GRP78、P53蛋白表達意義

    2019-03-25 01:20:46朱錦明
    中國計劃生育學雜志 2019年10期
    關鍵詞:發(fā)組內質網子癇

    方 芳 朱錦明

    1.徐州醫(yī)科大學研究生學院 (221004);2.徐州醫(yī)科大學附屬徐州婦幼保健院

    子癇前期常伴隨水腫、頭痛、惡心、胃痛及嘔吐等癥狀,分娩結束后通常會消失[1]。子癇前期會對妊娠女性肝、腎等臟器功能及大腦功能造成損傷,同時可導致胎兒供血量和供氧量不足,嚴重威脅胎兒和母親生命健康[2]。目前,學術界普遍認為子癇前期可能是由胎盤血液循環(huán)出現紊亂引起,但其確切發(fā)病機制尚未研究清楚。有研究報道,內質網應激反應影響胎盤功能、胎盤滋養(yǎng)細胞分化及凋亡,而子癇前期發(fā)病期間胎盤血氧量不足等有害因素會啟動內質網應激反應,因此,內質網應激相關調節(jié)功能異常是引發(fā)子癇前期的發(fā)病機制之一[3]。葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)與蛋白質折疊及組裝,P53蛋白主要與細胞凋亡有關,以上兩種蛋白分子被認為與胎盤滋養(yǎng)細胞內質網應激反應及相關凋亡途徑緊密關聯[4-5]。本研究通過測定GRP78、P53蛋白在不同類型子癇前期孕婦血清及胎盤組織中的表達,探討其生物學作用及臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    經本院醫(yī)學倫理委員會審批,且患者及家屬知情同意后,選取60例2018年1月—2018年12月本院婦產科接受治療的子癇前期妊娠女性為研究對象。納入標準:①診斷標準《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[6];②年齡23~45歲;③單胎妊娠;④均剖宮產分娩。排除標準:①合并糖尿病、慢性高血壓、心血管疾病及自身免疫疾??;②合并心肝腎功能障礙;③合并其他妊娠并發(fā)癥。60例均為重度子癇前期患者,其中早發(fā)子癇前期30例(早發(fā)組),年齡(29.3±5.8)歲,分娩孕周(33.2±6.2)周;晚發(fā)子癇前期30例(晚發(fā)組),年齡(28.6±5.3)歲,分娩孕周(36.7±7.2)周。另外選取同期本院健康妊娠女性30例為對照組,年齡(29.53±6.28)歲,分娩孕周(39.5±7.8)周。3組年齡比較無差異(P>0.05),分娩孕周比較有差異(P<0.05)。

    1.2 蛋白檢測

    1.2.1血清GRP78、P53蛋白采集3組外周靜脈血清,采用酶聯免疫吸附法檢測葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)及P53蛋白水平,試劑盒由cloud-clone corp公司生產,儀器采用瑞士Tecan公司的Freedom Evolyzer-2200型全自動酶免疫分析儀。

    1.2.2胎盤組織GRP78、P53蛋白中央帶母體面至胎兒面1.0cm×1.0cm×1.0cm,避開梗死及鈣化區(qū),去除母體面約4mm脫膜組織,用無菌生理鹽水清洗處理后分裝2管,各0.1g。取其中1份10%福爾馬林固定,24h后常規(guī)石蠟包埋切片,依次脫蠟、水化、過氧化物酶阻斷、抗原修復、PBS漂洗,免疫組織化學染色(SP)檢測GRP78、P53蛋白水平。GRP78一抗為兔抗人單克隆抗體,按1:100稀釋;P53蛋白一抗為鼠抗人單克隆抗體,按1:50稀釋,二抗為山羊免抗IgG,用二氨基聯苯胺呈色,光學顯微鏡下觀察。另一份胎盤組織迅速用液氮冷凍, -80℃保存,用半定量逆轉錄多聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測GRP78及P53mRNA表達。PCR循環(huán)參數分別為預變性5min(94℃)、變性0.5min(94℃)、退火0.5min(60℃)、延伸0.5min(72℃),共進行35個循環(huán)。GRP78上游引物5'-ATCAGGGCAACCGCATCACACC-3',下游引物5'-ACGCCTCGGCAGTTTCCTTCATTT-3',內部參照上游引物5'-CAGGCGTAGGAATATGGAC-3',下游引物5'-CGTGGCTTTACTTGGAGAA-3';P53上游引物5'-GACCTGGTCCTCTGACTGCT-3',下游引物5'-GATACGGCCAGGCATTGAAG-3',內部參照上游引物5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3',下游引物5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用spss23.0軟件統(tǒng)計分析。計數資料采用F檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 血清中GRP78、P53蛋白水平

    血清GRP78、P53蛋白水平對照組低于早發(fā)組和晚發(fā)組(P<0.05),早發(fā)組與晚發(fā)組無差異(P>0.05),見表1。

    表1 各組血清中GRP78、

    2.2 胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達

    胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達水平早發(fā)組和晚發(fā)組均高于對照組(P<0.05),早發(fā)組和晚發(fā)組比較無差異(P>0.05),見表2。

    表2 各組胎盤組織中GRP78 mRNA、P53 mRNA表達水平

    2.3 胎盤組織中GRP78、P53蛋白表達組化分析

    3組胎盤組織中均有GRP78、P53蛋白表達。GRP78 蛋白主要表達于細胞質,呈棕黃色染色,對照組表達在黃色和淺棕色,早發(fā)組和晚發(fā)組表達在深棕色和淺棕色區(qū)域,早發(fā)組和晚發(fā)組比對照組棕色顆粒表達增高。P53蛋白主要表達于細胞滋養(yǎng)層細胞、絨毛間質滋養(yǎng)層細胞及合體滋養(yǎng)層細胞。早發(fā)組和晚發(fā)組胎盤組織中GRP78、P53蛋白陽性表達高于對照組(P<0.05),早發(fā)組和晚發(fā)組比較無差異(P>0.05),見表3。

    表3 胎盤組織中GRP78、P53蛋白表達[例(%)]

    3 討論

    子癇前期屬妊娠期特發(fā)并發(fā)癥,輕度無明顯癥狀,但會導致患者體重快速增加,且手部和面部出現不同程度突發(fā)性腫脹;重度子癇前期可以導致嚴重頭痛、呼吸障礙、視力障礙、排尿減少及腹痛等癥狀[7]。近年研究報道,質網應激相關分子肌醇依賴酶1α(IRE1α)、GRP78 及內皮素 -1(ET-1)等在子癇前期表達異常,并參與子宮螺旋動脈重建及滋養(yǎng)細胞的增殖與分化,導致子癇前期發(fā)生[8-9]。本研究通過對子癇前期孕婦血清及胎盤組織中GRP78、P53蛋白水平變化,探討其臨床意義。

    GRP78是位于內質網上的一種應激蛋白,當內質網發(fā)生應激反應時,GRP78可通過提升自身表達量控制蛋白質折疊與轉運來阻止細胞凋亡,從而維持機體內環(huán)境穩(wěn)定[10]。本研究發(fā)現,GRP78蛋白、GRP78mRNA在子癇前期妊娠患者血清及胎盤組織中表達量均高于健康孕婦,但在早發(fā)與晚發(fā)組未見差異,提示GRP78參與了子癇前期發(fā)病機制。分析認為:是由于在子癇前期患者機體內存在氧化應激反應,使組織處于缺氧、低糖環(huán)境,誘導GRP78大量生成,造成GRP78升高[11]。王聳等[12]研究了GRP78蛋白在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞中的表達,發(fā)現子癇前期、早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期胎盤組織中GRP78蛋白均呈現高表達,且子癇前期程度組間未見差異,與本研究結果相符。

    P53蛋白是控制細胞周期及凋亡的抑癌基因P53的表達產物,具有調節(jié)細胞凋亡、DNA修復及抑制血管生成等作用。有研究證實,P53蛋白在胎盤滋養(yǎng)細胞中表達水平存在變化,可能與胎盤形成與浸潤有關[13]。王喜慧等對子癇前期發(fā)病及嚴重程度與 VEGF和P53表達相關性研究發(fā)現,患者血清及胎盤組織中VEGF與P53呈高度負相關,證實了P53通過調節(jié)VEGF水平引發(fā)血管內皮功能紊亂,進一步導致子癇前期發(fā)生[14]。本研究檢測結果顯示,子癇前期患者中P53表達高于對照組,但早發(fā)型與晚發(fā)型無明顯差異,提示P53參與了子癇前期的發(fā)生。分析認為:通過促進滋養(yǎng)細胞凋亡而影響胎盤形成所致P53表達升高。此外,有研究指出,在長時間缺氧狀態(tài)下,P53可通過p21途徑在轉錄因子E2F上發(fā)揮直接作用,抑制血管內皮生長因子表達,加重血管內皮損傷,繼而加重子癇前期病情[15]。

    本研究分析顯示,血清中GRP78、P53表達有明顯相關性,是由于P53表達可導致血管內皮功能紊亂,促使大量縮血管物質在血液中釋放,造成血管痙攣收縮,滋養(yǎng)細胞缺氧缺血,產生大量應激刺激,誘導GRP78大量表達,而GRP78的大量生產又加重機體氧化應激反應,造成血管損傷,兩者互相聯系進一步加重病情。

    綜上所述,子癇前期孕婦血清及胎盤組織中GRP78、P53蛋白及GRP78mRNA、P53mRNA均呈高表達,但表達量與病情無明顯相關性,預示GRP78、P53蛋白水平變化及其基因表達異??赡芘c子癇前期發(fā)病機制有關,可作為子癇前期早期預測指標,為臨床治療提供有效參考。但本研究由于時間限制,僅觀察了重度子癇前期患者,未分析血清GRP78、P53與患者臨床指標和妊娠結局關系,且樣本量過少,對上述不足需有待進一步研究。

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