microRNA-145在宮頸癌中的表達及其對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用

宮頸癌發(fā)病率在全球女性腫瘤中位居第3位，每年約有52 900例新發(fā)病例，且每年約有27 400例患者死于宮頸癌［1］。宮頸癌發(fā)病原因復雜，目前研究認為人乳頭瘤狀病毒（human papilloma virus，HPV）是宮頸癌發(fā)病的重要因素，如HPV-16、HPV-18等感染常導致癌基因異常持續(xù)活化、抑癌基因失活，從而促進宮頸癌的發(fā)生［2］。microRNA-145在多種腫瘤和其周圍正常組織中表達存在顯著差別，micro-RNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，但其在宮頸癌中的作用機制尚不十分明確。本研究旨在檢測宮頸癌中的microRNA-145表達并分析其與臨床病理的意義，從體外細胞學水平研究microRNA-145過表達對宮頸癌細胞中的Cateninδ-1影響，以及對Wnt/βcatenin信號通路活化的影響，初步探討microRNA-145在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2002年1月至2004年12月解放軍464醫(yī)院收治的62例宮頸癌患者的組織標本，其中48例行根治性子宮切除加盆腔淋巴結清掃術、14例行宮頸錐切術。患者年齡為27～75歲，平均年齡47歲。根據(jù)microRNA-145表達平均水平（0.324），將62例宮頸癌患者分為microRNA-145高表達組（表達水平≥0.324）30例和低表達組（表達水平＜0.324）32例。患者術前均未接受放、化療，病理切片均由病理醫(yī)師重新復習并確認為宮頸癌。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.1.2 細胞 人宮頸癌細胞株HeLa細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學院細胞資源中心。于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和實時熒光定量PCR方法檢測 宮頸癌組織離體后迅速置于液氮中保存，RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，所有樣本按照試劑盒說明書使用。從組織中提取并測定RNA質(zhì)量和濃度，進行逆轉錄獲得cDNA，于-20℃條件下保存。使用TaqMan microRNA檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測（購自美國Thermo Fisher公司）。microRNA-145引物序列正向為5'-TGGATTTCGCTC TTCCCA-3'，反向為 5'-TTGACACTCATCCGTGAGG ACC-3'。反應條件為95℃5 min變性、95℃20 s退火、60℃30 s延伸，共40個循環(huán)，以U6 snRNA表達作為內(nèi)參。所有樣品均設3個副孔，取平均循環(huán)閾值。采用PCR-反向點雜交技術檢測宮頸HPV感染狀態(tài)，具體步驟按HPV基因分型檢測試劑盒（購自廣東凱普生物科技股份有限公司）操作說明進行。

1.2.2 細胞轉染 在細胞培養(yǎng)6孔板中每孔接種4×105/mL細胞懸液2 mL，以不含抗生素的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，將microRNA-145表達質(zhì)粒和無義對照質(zhì)粒（購自上海吉凱基因公司）利用轉染試劑Lipo?fectamine 2000（購自美國Invitrogen公司）分別轉染入HeLa細胞中，細胞轉染48 h后，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞免疫熒光染色 在細胞培養(yǎng)12孔板中提前12 h每孔接種5×104/mL細胞懸液1 mL，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton破膜，3%BSA室溫封閉1 h，加入購自美國Santa Cruz公司的小鼠抗人β-catenin單克隆抗體（1：50），4℃孵育過夜，PBS沖洗，加入購自美國Invitrogen公司的羊抗小鼠IgG Alexa Flour488（1：200），避光室溫孵育1 h。PBS沖洗，加入4，6-二乙?；?2-苯基吲哚酸鹽（DAPI），避光室溫10 min；PBS沖洗，將蓋玻片移至載玻片上，抗熒光衰減封片劑封片。

1.2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測 利用Top Flash測定細胞內(nèi)TCF/LEF的轉錄活性，將Top Flash（100 ng）及海腎熒光素酶胸苷激酶（50 ng）共轉染于HeLa細胞中，利用Promega雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。構建microRNA-145野生型及靶序列突變型載體（野生型為AACUGGA、突變型為AAUCA?GA）。將HeLa細胞隨機分為野生型+microRNA-145組、野生型+內(nèi)參組、突變型+microRNA-145組、突變型+內(nèi)參組。Lipofectamine 2000轉染相應的質(zhì)粒與microRNA-145。

1.2.5 Western blot法檢測 各組細胞以RIPA裂解液提取總蛋白，以35 μg/孔上樣，250 mA電流下轉膜，置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入均購自美國Ab?cam公司的一抗小鼠抗人C-MYC和CyclinD1抗體（1：500），4℃孵育過夜，加入購自美國Santa Cruz公司羊抗小鼠二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光法顯影。

1.2.6 隨訪 62例患者出院后均行隨訪，隨訪時間為12～48個月，中位隨訪時間為38個月。生存患者為44例、死亡12例、失訪6例。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。microR?NA-145表達水平與患者臨床病理指標之間的相關性分析采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者組織中microRNA-145表達的臨床病理意義及其預后價值

宮頸癌患者組織中的microRNA-145表達與FIGO分期、淋巴結轉移及HPV感染顯著性相關，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05，表1）。生存分析表明，microRNA-145低表達患者生存時間［（41.28±2.00）個月］較高表達患者［（46.06±0.95）個月］短（P＜0.05，圖1）。

2.2 microRNA-145對HeLa細胞中β-catenin表達定位的作用

細胞免疫熒光染色結果發(fā)現(xiàn)，對照組細胞中βcatenin蛋白主要分布于細胞核及胞漿內(nèi)，而過表達microRNA-145組HeLa細胞中β-catenin蛋白明顯減少，且多分布于胞漿中，提示microRNA-145能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路（圖2）。

表1 宮頸癌組織中microRNA-145表達與各臨床病理參數(shù)間的關系

圖1 microRNA-145低表達和高表達患者的生存曲線

2.3 microRNA-145對HeLa細胞中TCF/LEF轉錄活性的作用

雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞中過表達microRNA-145組與對照組相比被顯著抑制（t=3.265，P=0.047），進一步證實了 microRNA-145對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用（圖3）。

圖2 對照組及過表達microRNA-145組的HeLa細胞中β-catenin表達

圖3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HeLa細胞中的TCF/LEF轉錄活性

2.4 microRNA-145對HeLa細胞中Cateninδ-1的作用

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示，野生型+mi?croRNA-145組熒光素酶活性較野生型+內(nèi)參組明顯降低（P＜0.05），表明microRNA-145能夠靶向抑制HeLa細胞中Cateninδ-1基因的啟動子活性（圖4）。

圖4 microRNA-145對HeLa細胞中Cateninδ-1的影響

2.5 過表達microRNA-145對HeLa細胞Cateninδ-1、C-MYC和CyclinD1表達的作用

Western blot法檢測結果發(fā)現(xiàn)，過表達microR?NA-145組 HeLa細胞中 Cateninδ-1、C-MYC 和 Cy?clinD1蛋白表達較對照組降低，也證實了microRNA-145對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用（圖4）。

3 討論

研究表明，microRNA-145可通過作用于N-RAS和VEGFA抑制乳腺癌的進展，通過作用于CDK6和Sp1增加卵巢癌細胞對順鉑化療方案的敏感性［3-4］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達microRNA-145可增加前列腺癌細胞對于放療的敏感性［5］。研究報道，microR?NA-145在結腸癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤類型中均具有抑癌作用，但其具體的分子機制仍有待深入研究［6-8］。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的活化可使β-catenin表達增加，并進入細胞核啟動TCF/LEF的轉錄，激活下游眾多靶基因，參與細胞分化、增殖、運動等幾乎所有的生命事件。研究證實，Wnt信號通路在包括宮頸癌等多種腫瘤類型中均存在異?；罨?-9］。Cateninδ-1是一種細胞黏附輔助因子，可通過促進β-catenin在細胞核內(nèi)集聚，參與活化Wnt/β-catenin信號通路。通過生物信息學軟件Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫預測Cateninδ-1可能為microRNA-145靶基因［10］。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-145在宮頸癌中具有抑癌作用。Azizmohammadi等［8］檢測microRNA-145在35例宮頸癌患者組織中的表達，發(fā)現(xiàn)microRNA-145低表達與宮頸癌高FIGO分期、淋巴結轉移及血管侵犯密切相關，且患者總生存時間短。Liang等［11］在中國女性宮頸鱗狀細胞癌患者組織中也發(fā)現(xiàn)microRNA-145低表達，且其低表達提示預后不良。另有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中microRNA-145低水平與腫瘤分化、淋巴結轉移、HPV感染及FIGO分期密切相關，且對放療敏感性差［12］。

本研究通過檢測microRNA-145在62例宮頸癌患者組織中的表達發(fā)現(xiàn)，其與淋巴結轉移、臨床分期及HPV陽性率密切相關，且microRNA-145低表達患者預后較差，與文獻報道的結果基本一致［8］。進一步提示microRNA-145表達下調(diào)可能在宮頸癌的演進中具有重要作用。另外，本研究結果顯示，microR?NA-145低表達也與患者HPV16感染相關，可能的機制是由于microRNA-145位于基因脆性位點，與HPV16整合位點相鄰近，所以當HPV與宿主細胞的整合時很可能會抑制microRNA-145前體形成。研究報道，microRNA-145在宮頸癌細胞中下調(diào)，而mi?croRNA-145過表達可抑制宮頸癌細胞的生長、侵襲和轉移［8］。目前研究認為，microRNA-145影響宮頸癌演進的可能分子機制包括microRNA-145可靶向作用于KRAS、ERK5、RREB1等發(fā)揮作用，促進癌細胞凋亡并增加抗癌藥物的敏感性；microRNA-145可抑制核心干細胞轉錄因子Sox2、Nanog、Oct4表達抑制宮頸癌細胞干細胞樣特性［13-14］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-145下調(diào)使Wnt/β-catenin信號通路激活可能是促進結腸癌發(fā)生的關鍵事件，但關于microR?NA-145對宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞中microR?NA-145過表達可抑制β-catenin進入細胞核表達，抑制TCF/LEF轉錄活性及C-MYC和CyclinD1表達，表明在宮頸癌細胞中microRNA-145對Wnt/β-catenin信號通路也具有抑制作用，很可能也是其抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機制。

Cateninδ-1是連環(huán)蛋白Armadillo家族的成員，參與細胞骨架重塑和調(diào)節(jié)Rho GTP酶。Cateninδ-1可以與轉錄因子Kaiso特異性結合，抑制Kaiso活性，而Kaiso具有抑制β-catenin/TCF活化的作用，Cateninδ-1可促進Wnt/β-catenin信號通路活化［15］。該研究發(fā)現(xiàn)，Cateninδ-1也是PAKs特別是PAK4作用的底物和結合蛋白。Cateninδ-1也可通過與PAK4作用，促進β-catenin由胞漿入核，激活Wnt/β-catenin信號通路。本研究中，microRNA-145能夠靶向抑制HeLa細胞中Cateninδ-1基因及蛋白的表達，提示microRNA-145抑制宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路可能與其對Cateninδ-1的抑制作用有關。

綜上所述，本研究對宮頸癌患者組織中microR?NA-145表達的臨床病理意義及其預后價值進行分析，并從細胞學水平分析宮頸癌細胞中microRNA-145對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用，對探索microRNA-145在腫瘤演進中的作用提供了實驗依據(jù)。但是microRNA-145能否應用于宮頸癌臨床診斷和作為治療干預靶點，仍需要大規(guī)模樣本進行廣泛驗證，且其作用的分子機制也需進一步深入研究。