兒童呼吸道流感嗜血桿菌分離株耐藥性與ftsI基因分型研究

謝成彬， 王頻佳， 吳雨露， 顏 源， 易 娟， 蘇 喆

·論著·

兒童呼吸道流感嗜血桿菌分離株耐藥性與ftsI基因分型研究

謝成彬1， 王頻佳2， 吳雨露1， 顏 源1， 易 娟1， 蘇 喆1

目的 調查呼吸道感染患兒流感嗜血桿菌分離株的耐藥性與ftsI基因的關系。方法 2011年6月—2012年9月，收集呼吸道感染患兒呼吸道標本中分離到的流感嗜血桿菌，用微量肉湯稀釋法測定常用抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)；用Nitrocefin紙片法檢測細菌的β內酰胺酶；用聚合酶鏈反應(PCR)技術對分離株進行ftsI基因分型；比較不同ftsI基因型菌株對常用抗菌藥物的耐藥性。結果 473株流感嗜血桿菌中產β內酰胺酶菌株占51.8%(245/473)，ftsI基因突變率為33.4%(158/473)；β內酰胺酶基因陰性氨芐西林耐藥型菌株(gBLNAR)以Group Ⅰ/Ⅱ型為主(113/154)，68.1%(77/113)的該型菌株對氨芐西林敏感，85.4%(35/41)的gBLNAR Group Ⅲ菌株對氨芐西林不敏感；gBLNAR菌株對頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢曲松和阿莫西林-克拉維酸等β內酰胺類抗生素MIC90和耐藥率明顯高于gBLNAS(敏感)菌株(P<0.01)，對左氧氟沙星、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑等非β內酰胺類抗菌藥物的MIC90和耐藥率與gBLNAS菌株相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；gBLNAR Group Ⅲ菌株對β內酰胺類抗生素的MIC90和耐藥率高于gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ菌株(P<0.01)，兩者對非β內酰胺類抗菌藥物的MIC90和耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 呼吸道感染患兒呼吸道流感嗜血桿菌分離株發(fā)生ftsI基因突變的情況較為常見，突變以Group Ⅰ/Ⅱ型為主，明顯影響氨基青霉素類和某些第二代頭孢菌素的抗菌活性。

流感嗜血桿菌； 耐藥性；ftsI基因

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見病原菌, 也可引起全身性感染。氨芐西林是治療流感嗜血桿菌感染的首選藥。然而，流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率不斷上升，已經涉及β內酰胺類、氯霉素、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑和大環(huán)內酯類等多種抗菌藥物[1]。其對氨芐西林的耐受性，一是β內酰胺酶的產生(常見為TEM-1型或ROB-1型)，導致氨芐西林被水解失活；二是參與細菌細胞壁合成的青霉素結合蛋白(PBP)的結構發(fā)生改變，導致其對氨芐西林的親和力下降。后一種機制導致的氨芐西林耐藥株，被稱為β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌(BLNAR)[2]。近年來，臨床不斷分離到上述2種機制同時出現導致的阿莫西林-克拉維酸耐藥株[3]，被稱為β內酰胺酶陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥流感嗜血桿菌(β-lactamase positive amoxicillin-clavulanate resistant, BLPACR)。本研究對成都地區(qū)兒童呼吸道感染患兒呼吸道分離的流感嗜血桿菌進行PBPs基因分型，了解該基因突變對抗菌藥物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2011年6月—2012年9月從四川省婦幼保健院兒科病區(qū)的呼吸道感染患兒(0～5歲)合格痰標本中,分離獲得流感嗜血桿菌473株。

1.1.2 主要試劑 抗菌藥物氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸(2∶1)、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑(1∶19)，β內酰胺酶檢測試劑(Nitrocefin紙片)和HTM培養(yǎng)基添加劑(NAD和氯化血紅素)購自英國OXOID公司；標準菌株流感嗜血桿菌ATCC 49247(β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥株)、ATCC 10211(β內酰胺酶陰性氨芐西林敏感株)、ATCC 35056(β內酰胺酶陽性株)和最低抑菌濃度(MIC)藥敏板條(各受試抗菌藥物均設15個梯度濃度，濃度范圍0.016～256 mg/L)購自溫州康泰生物技術有限公司；細菌基因組DNA 抽提試劑盒(含蛋白酶K)、溶菌酶、Taq酶(Taq HS)、2.5 mmol/L dNTP Mixture、20 mmol/L 10×PCR Buffer (Mg2+plus)和100 bp DNA Ladder (Dye Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物合成 參考相關文獻[4-5]和GenBank中相關基因序列(序列號為NC_000907)分別針對流感嗜血桿菌的β內酰胺酶基因設計引物BL、特異性外膜蛋白P6基因設計引物P6、無Asn-526-Lys氨基酸置換的ftsI基因設計引物PBP3-S、存在Ser-385-Thr氨基酸置換的ftsI基因設計引物PBP3-BLN，由上海生物工程技術有限公司合成，引物序列及產物長度見表1。

表1 PCR引物序列

1.1.4 主要儀器 聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀ABI-9700購自美國應用生物系統(tǒng)有限公司，Ultraspec2000分光光度計購自美國Pharmacia公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司，高速冷凍離心機HC-3018R購自安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離培養(yǎng) 采用負壓吸引方法采集痰液標本，將符合質量標準(白細胞≥25個/LPF，上皮細胞≤10個/LPF)的痰液標本接種嗜血桿菌平皿，35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24～48 h，根據菌落形態(tài)、革蘭染色和糖發(fā)酵試驗鑒定到種，剔除同一患兒重復株，純化建株保藏。

1.2.2 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法操作指南進行抗菌藥物敏感性試驗[6]，以Mueller-Hinton(MH)肉湯、酵母提取物和HTM培養(yǎng)基添加劑為基礎制備HTM肉湯，調整菌液濃度為(1～4)×108CFU/mL，35 ℃、5% CO2培養(yǎng)20～24 h。流感嗜血桿菌ATCC 49247、ATCC 10211、ATCC 35056作為藥敏試驗質控菌。各菌株均用Nitrocefin紙片進行β內酰胺酶檢測。

1.2.3 DNA模板制備 各菌株用HTM肉湯復蘇后，離心收集沉淀，嚴格按試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.2.4 PCR擴增 反應體系：DNA模板2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1.5 μL，dNTP 4 μL， PCR緩沖液5 μL，無菌去離子水補足至50 μL。擴增條件：94 ℃預變性10 min，隨后94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次，最后72 ℃再延伸10 min，擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下判讀結果。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 使用WHONET5.5和SAS10.0軟件對數據進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細菌產β內酰胺酶及其對氨芐西林和阿莫西林-克拉維酸敏感性

流感嗜血桿菌產β內酰胺酶的比率為51.8%(245/473)，對氨芐西林的耐藥率為57.9%(274/473)，對阿莫西林-克拉維酸的耐藥率為1.3%(6/473)。245株產酶株中對阿莫西林-克拉維酸敏感241株(98.4%，MIC≤4/2 mg/L)，耐藥4株(1.6%，MIC≥8/4 mg/L)。228株非產酶株中對氨芐西林敏感156株(68.4%，MIC≤1 mg/L)，中介43株(18.9%，MIC=2 mg/L)，耐藥29株(12.7%，MIC≥4 mg/L)。

2.2 細菌的基因分型及其對氨芐西林敏感性

根據PCR基因分型結果，流感嗜血桿菌被分為4種基因型[4]：①β內酰胺酶基因陰性氨芐西林敏感型菌株(gBLNAS)，bla基因陰性和ftsI基因上無導致氨基酸置換的突變；②β內酰胺酶基因陰性氨芐西林耐藥型菌株(gBLNAR)，bla基因陰性和ftsI基因上有導致氨基酸置換的突變；③β內酰胺酶基因陽性氨芐西林耐藥型菌株(gBLPAR)，bla基因陽性和ftsI基因上無導致氨基酸置換的突變；④β內酰胺酶基因陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥型菌株(gBLPACR)，bla基因陽性和ftsI基因上有導致氨基酸置換的突變。其中，gBLNAR 和gBLPACR菌株又根據ftsI基因上的氨基酸置換模式被分為不同亞型[5]：①Ⅰ/Ⅱ型(gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ和gBLPACR Group Ⅰ/Ⅱ)，ftsI基因可突變位點有Asn-526-Lys或Arg-517-His氨基酸置換，若ftsI基因發(fā)生Asn-526-Lys氨基酸置換PBP3-S引物將無擴增產物出現；②Ⅲ型(gBLNAR Group Ⅲ和gBLPACR Group Ⅲ)，ftsI基因高突變位點有Ser-385-Thr氨基酸置換，若ftsI基因發(fā)生Ser-385-Thr置換PBP3-BLN引物可獲得擴增產物。見圖1。

M: 100 bp DNA Marker; 1: P6 gene; 2: β-lactamase gene; 3: PBP3-S gene; 4: PBP3-BLN gene.

圖1 流感嗜血桿菌PCR基因分型結果電泳圖

Figure 1 Electrophoretogram of PCR products forH.influenzaeftsIgenotyping

473株流感嗜血桿菌中：158株(33.4%)發(fā)生ftsI基因突變，其中113株(23.9%)為gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ菌株，41株(8.7%)為gBLNAR Group Ⅲ菌株，2株(0.4%)為gBLPACR Group Ⅰ/Ⅱ菌株，2株(0.4%)為gBLPACR Group Ⅲ菌株。315株(66.6%)未發(fā)生ftsI基因突變， 74株(15.6%)為gBLNAS菌株，241株(51.0%)為gBLPAR菌株。gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ菌株對氨芐西林的MIC50與gBLNAS菌株的MIC50相同，但MIC90和耐藥率明顯高于gBLNAS菌株(χ2=6.92，P<0.01)；gBLNAR Group Ⅲ菌株的MIC50、MIC90和耐藥率明顯高于gBLNAS菌株(χ2=41.08，P<0.01)，并且也明顯高于gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ菌株(χ2=27.67，P<0.01)。而gBLPAR菌株和gBLPACR菌株對氨芐西林的MIC50、MIC90和耐藥率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=-6.91，P>0.05)。見表2、表3。

2.3 細菌的基因分型及其對其他抗菌藥物敏感性

β內酰胺類抗生素對流感嗜血桿菌gBLNAR菌株的MIC50和MIC90高于gBLNAS菌株(≥2倍和>4倍)，其中頭孢曲松和阿莫西林-克拉維酸MIC90雖然升高明顯(≥4倍)，但低于其耐藥折點，細菌對其仍保持很高的敏感率。左氧氟沙星和阿奇霉素對gBLNAR菌株的MIC50和MIC90與gBLNAS菌株相差無幾(≤2倍)。甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑對gBLNAR菌株和gBLPAR菌株的MIC50和MIC90明顯高于gBLNAS菌株(4倍)。除阿奇霉素和頭孢曲松外，其他抗菌藥物對gBLPAR菌株的MIC50和MIC90高于gBLNAS菌株(>4倍)。左氧氟沙星、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑對不同亞型的gBLNAR菌株的MIC50和MIC90相差無幾(差別≤2倍)，但β內酰胺類抗生素對gBLNAR Group Ⅲ型菌株的MIC50和MIC90高于gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ型菌株(≥4倍)。見表4。

表2 473株流感嗜血桿菌的基因分型

表3 流感嗜血桿菌的ftsI基因型和對氨芐西林的敏感性

表4 流感嗜血桿菌的ftsI基因型和對其他抗菌藥物敏感性

continued table 4

AntimicrobialagentGenotypenMIC50/(mg/L)MIC90/(mg/L)MICRange/(mg/L)gBLNARGroupIII410．250．50．03?0．5gBLPAR2410．030．060．016?0．25Amoxicillin?clavulanategBLNAS740．520．06?8gBLNARGroupI/II113140．25?16gBLNARGroupIII414162?32gBLPAR241240．25?16LevofloxacingBLNAS740．0160．060．016?0．25gBLNARGroupI/II1130．0160．060．016?4gBLNARGroupIII410．0160．1250．016?4gBLPAR2410．0310．016?32AzithromycingBLNAS74120．125?32gBLNARGroupI/II113140．125?64gBLNARGroupIII41140．125?64gBLPAR241120．06?64Trimethoprim?sulfamethoxazolegBLNAS740．2580．125?32gBLNARGroupI/II1131320．125?128gBLNARGroupIII411320．125?128gBLPAR2411320．125?128

3 討論

PBP是細菌肽聚糖層的一種特殊膜蛋白，可作為β內酰胺類抗生素的特異性結合靶位。長久以來一直認為PBP的結構改變導致其與β內酰胺類抗生素親和力降低是引起細菌耐藥的重要機制，而且這一機制主要發(fā)生在革蘭陽性菌中[7-8]，在革蘭陰性菌中罕見[9]。近年研究發(fā)現，流感嗜血桿菌對β內酰胺類的耐藥機制同樣涉及PBP親和力的下降[10-12]。在流感嗜血桿菌的各種PBP中，介導肽聚糖合成的PBP3的改變與耐藥性產生密切相關，PBP3由染色體上ftsI基因編碼合成，ftsI基因上不少位點的突變都可影響PBP3的空間構象及其親和力，在抗菌藥物的選擇壓力下，ftsI突變株可被自然選擇，使β內酰胺類抗生素的活性受到不同程度的影響[1]。本研究分離到的流感嗜血桿菌，產酶株高達51.8%，說明產β內酰胺酶仍然是其主要的耐藥機制，而氨芐西林的耐藥率(57.9%)高于產酶率，則說明除了產β內酰胺酶外還有其他的耐藥機制，如ftsI基因突變引起的PBP3改變，因為ftsI基因型篩查發(fā)現gBLNAR和gBLPACR菌株的總分離率已高達33.4%。Ubukata等[13]根據推導的氨基酸置換模式將流感嗜血桿菌分為3型：Group Ⅰ，在KTG基序附近發(fā)生Arg-517-His置換；Group Ⅱ，在KTG基序附近發(fā)生Asn-526-Lys置換；Group Ⅲ，除了KTG基序附近發(fā)生Asn-526-Lys置換外，在SSN基序還可發(fā)生Met-37-7Ile、Ser-385-Thr和(或)Leu-389-Phe置換。本研究ftsI基因分型結果發(fā)現，gBLNAR分離株以Group Ⅰ/Ⅱ型為主(113/154)，68.1%(77/113)的Group Ⅰ/Ⅱ菌株對氨芐西林敏感，而85.4%的Group Ⅲ菌株對氨芐西林不敏感，與國外研究基本一致[14-19]。結果表明，ftsI基因上KTG基序的突變對PBP3的空間構象影響較小，PBP3仍對氨芐西林保持較高的親和力；而SSN基序的突變對PBP3的空間構象影響較大，PBP3對氨芐西林親和力明顯下降。成都地區(qū)兒童呼吸道分離株的ftsI基因有哪些突變位點尚待確認。

在對其他常用抗菌藥物的MIC進行分析時發(fā)現，左氧氟沙星、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑等非β內酰胺類抗生素對gBLNAR菌株的MIC90與gBLNAS菌株基本一致，說明ftsI基因突變對非β內酰胺類抗生素抗菌活性的影響很??；阿莫西林-克拉維酸、頭孢克洛、頭孢呋辛和頭孢曲松等β內酰胺類抗生素對gBLNAR菌株的MIC90明顯高于gBLNAS菌株，但90%以上gBLNAR菌株仍對頭孢曲松保持敏感，說明ftsI基因突變對PBP3與氨基青霉素類、第二代頭孢菌素的親和力影響較大，對PBP3與第三代頭孢菌素的親和力影響相對較小；阿莫西林-克拉維酸、頭孢克洛、頭孢呋辛和頭孢曲松等β內酰胺類抗生素對gBLNAR Group Ⅲ菌株的MIC90均高于gBLNAR Group Ⅰ/Ⅱ菌株，說明ftsI基因SSN基序的突變比KTG基序的突變更顯著地降低細菌對頭孢菌素的敏感性[20]。因此，對于gBLNAR和gBLPACR菌株ftsI基因突變株感染的治療，可首選第三代頭孢菌素或左氧氟沙星等其他受ftsI基因突變影響較小的抗菌藥物。因此，在日常工作中快速識別這些耐藥菌株非常重要[21]。

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Antimicrobial resistance andftsIgenotyping ofHaemophilusinfluenzaeisolates from respiratory tract in children

XIE Chengbin, WANG Pinjia, WU Yulu, YAN Yuan, YI Juan, SU Zhe

. (Department of Laboratory Medicine, Sichuan Provincial Hospital of Women and Children, Chengdu 610045, China)

Objective To investigate the relation between antimicrobial resistance andftsIgene encoding PBP3 ofHaemophilusinfluenzaeisolated from respiratory tract in children. Methods From June 2011 to September 2012,H.influenzaeisolates were collected from respiratory tract in children. Minimum inhibitory concentrations were determined by mircrobroth dilution with commonly-used antibiotics. Beta-lactamase production was detected by Nitrocefin disk test. PCR technique was employed forftsIgenotyping. Antimicrobial resistance was compared between beta-lactamase-nonproducing, ampicillin-resistant (gBLNAR) and beta-lactamase-nonproducing, ampicillin-susceptible (gBLNAS) isolates as well as between gBLNAR Group I/II and gBLNAR Group III isolates. Results Beta-lactamase was produced in 51.8% (245/473) of the isolates whileftsIgene mutation was positive in 33.4% (158/473) of the isolates. The dominant genotype of gBLNAR isolates was Group I/II type (113/154), and 68.1% of gBLNAR Group I/II isolates were susceptible to ampicillin (77/113) whereas 85.4% of gBLNAR Group III isolates were non-susceptible to ampicillin (35/41). MIC90and resistance rate of gBLNAR isolates were higher than those of gBLNAS isolates for cefaclor, cefuroxime, ceftriaxone and amoxicillin-clavulanate (P<0.01), and similar to those of gBLNAS isolates for levofloxacin, azithromycin and trimethoprim-sulfamethoxazole (P>0.05). MIC90and resistance rate of gBLNAR Group III isolates were higher than those of gBLNAR Group I/II isolates for those beta-lactams mentioned previously (P<0.01), but no difference was observed among gBLNAR isolates for non-beta-lactam antibiotics. Conclusions High prevalence offtsIgene mutation is identified in theH.influenzaeisolates from respiratory tract in Chengdu children, predominantly the gBLNAR Group I/II type isolates, which is associated with altered susceptibility to aminopenicillins and some second generation cephalosporins.

Haemophilusinfluenzae; antimicrobial resistance;ftsIgene

四川省衛(wèi)生廳科研課題(120493，130246)。

1. 四川省婦幼保健院檢驗科，成都 610045； 2. 成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院。

謝成彬(1977—)，男，碩士，主管技師，主要從事細菌耐藥機制和醫(yī)院感染分子流行病學研究。

王頻佳，E-mail:619364947@qq.com。

R378.4

A

1009-7708(2015)04-0324-06

2013-10-09

2014-12-15