硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)生長(zhǎng)生理特性及次生代謝的影響

繆雨靜，關(guān)佳莉，曹藝雯，沙俊濤，唐曉清*，耿麗，王磊

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所，江蘇 南京 210095; 2.句容市茅山仙草中藥材專業(yè)合作社，江蘇 句容 212404)

硫作為植物所需中量元素之一，約占植株干重的0.1%，雖不是植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性組成元素，但它卻發(fā)揮極其重要的作用[1]。硫素是一些氨基酶的組成成分，也是蛋白質(zhì)合成的必須元素，有助于酶和維生素的形成。同時(shí)，硫素還參與植物光合作用，為葉綠素合成所必需[2]。因此，硫素在植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量形成以及初次生物質(zhì)積累過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

植物對(duì)硫元素的吸收，除從土壤中獲得硫酸鹽外，還能直接吸收大氣中的SO2，此外，植物還可用根系和葉片吸收S2-、HSO3-和SO32-等形態(tài)的無(wú)機(jī)硫素以及有機(jī)含硫化合物作為營(yíng)養(yǎng)，以保證其正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[3]。硫素被吸收后，會(huì)在植物體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的還原同化，最終才能被植物體所利用。植物中的硫酸鹽同化主要包括3個(gè)階段：活化階段、還原階段和半胱氨酸(cysteine, Cys)合成階段[4-5]。SO42-化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，首先會(huì)通過(guò)ATP-硫酸化酶(ATP sulfurylase, ATPS)和APS磺基轉(zhuǎn)移酶(APS reductase, APR)氧化形成SO32-，然后經(jīng)硫化物還原酶形成硫化物(S2-)，最后在半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, OAS-TL)的催化下形成半胱氨酸，其為合成植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸酶的來(lái)源[6]。因此，不同形態(tài)的硫素可能參與到同化過(guò)程的特定階段，對(duì)植物硫素吸收形成一個(gè)反饋?zhàn)饔茫瑥亩绊懼参飳?duì)硫元素的吸收和利用。此外，由于硫酸鹽與硝酸鹽同化是協(xié)調(diào)進(jìn)行的，所以不同的硫素形態(tài)同樣會(huì)影響植物對(duì)氮素的吸收同化及利用。對(duì)于需硫量較大的十字花科植物而言[7-8]，硫素在次生代謝過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用，如十字花科植物中的芥子油苷合成過(guò)程中伴隨著硫的同化，硫吸收同化產(chǎn)物可直接應(yīng)用于芥子油苷的合成途徑中[9]。在菘藍(lán)(Isatisindigotica)中，氮硫素配施對(duì)于葉片靛藍(lán)和靛玉紅的含量大致呈現(xiàn)為高低硫抑制，適宜硫濃度促進(jìn)的趨勢(shì)[10]。

菘藍(lán)是十字花科菘藍(lán)屬兩年生草本植物，根和葉均可入藥。葉入藥為大青葉，根入藥為板藍(lán)根，具有清熱解毒、涼血等功效。兩者均為我國(guó)常用的清熱解毒之要藥[11]。目前對(duì)于菘藍(lán)的營(yíng)養(yǎng)研究主要集中在氮素營(yíng)養(yǎng)方面，而硫元素對(duì)菘藍(lán)生長(zhǎng)的影響尚無(wú)系統(tǒng)研究。因此，本研究通過(guò)分析不同硫素形態(tài)對(duì)菘藍(lán)生長(zhǎng)、光合生理、氮硫代謝及次生物質(zhì)積累的影響，尋找適宜提高菘藍(lán)藥材品質(zhì)的硫素形態(tài)，旨在為合理使用硫素肥料及提高大青葉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

供試材料菘藍(lán)種子為來(lái)自內(nèi)蒙古的栽培居群，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康才教授鑒定為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)的角果(生產(chǎn)中稱種子)。試驗(yàn)于2017年8-12月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院陽(yáng)光溫室內(nèi)進(jìn)行，以蛭石和珍珠巖(2∶1)作為栽培基質(zhì)進(jìn)行育苗，于4葉期進(jìn)行間苗，每盆留10株長(zhǎng)勢(shì)一致的菘藍(lán)幼苗，進(jìn)行后期Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，分別為Na2SO4，Na2SO3，NaHSO3，Na2S，Na2S2O35種不同形態(tài)的硫素，并以無(wú)硫作為對(duì)照處理(CK)。各處理施以改良的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，微量元素和鐵元素參考Zheng等[12]的研究。育苗期施1/4 Hoagland(無(wú)硫)營(yíng)養(yǎng)液，處理期施添加不同形態(tài)硫素的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，硫素濃度統(tǒng)一為2.5 mmol·L-1，每5 d澆灌一次，處理45 d后，進(jìn)行采樣，鮮樣葉片凍于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，干樣葉片烘干至恒重，打粉，待用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1生物量測(cè)定 隨機(jī)選取10株菘藍(lán)，洗凈拭干后于105 ℃殺青15 min后于60 ℃烘干至恒重，測(cè)量菘藍(lán)地上部位(指莖基部至最長(zhǎng)葉片之間的距離稱株高)長(zhǎng)度，并稱其鮮干重，葉片烘干粉碎后過(guò)四號(hào)篩(250 μm)，用于活性成分含量測(cè)定。

1.3.2光合參數(shù)測(cè)定 測(cè)定前提前將菘藍(lán)放置陽(yáng)光下30 min充分適應(yīng)，于晴朗少云上午9-11時(shí)，選取菘藍(lán)植株由內(nèi)至外的第二輪功能葉，用 LI-6400 型光合儀(美國(guó)LI-COR公司)于1000 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，測(cè)定菘藍(lán)葉片凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance,Gs)、胞間二氧化碳濃度(intercellular CO2concentration,Ci)和蒸騰速率(transpiration rate,Tr)，以及計(jì)算水分利用率(water use efficiency, WUE)每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.3.3光合色素含量測(cè)定 參照王學(xué)奎等[13]的方法測(cè)定菘藍(lán)葉片的光合色素含量。稱取0.05 g葉片剪成碎片，置于10 mL 95%乙醇內(nèi)，避光浸提至葉片為無(wú)色。用紫外分光光度法于665，649和470 nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素和葉綠素總量，各處理3次重復(fù)。計(jì)算公式如下：Ca=13.95×A665-6.88×A649；Cb=24.96×A649-7.32×A665；Cx·c=(1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb)/245。

1.3.4氮代謝酶和硫代謝酶活性測(cè)定 硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)、谷氨酸合成酶(glutamate synthetase, GOGAT)、ATP-硫酸化酶、APS磺基轉(zhuǎn)移酶和半胱氨酸合成酶活性采用南京建成生物研究所試劑盒測(cè)定，各處理3次重復(fù)。

1.3.5可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸含量測(cè)定 采用苯酚硫酸法測(cè)定可溶性糖含量，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量，酸性茚三酮法測(cè)定游離氨基酸含量[13]。

1.3.6靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定 參照2015版《中國(guó)藥典》方法提取、測(cè)定靛藍(lán)和靛玉紅含量，略作修改[11]。超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)條件:分析柱為Aglient ZORBA×Eclidise Plus C18 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水(72∶28，v/v)； 流速 0.30 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 289 nm；進(jìn)樣體積 2 μL。分別以靛藍(lán)、靛玉紅的色譜峰面積(Y)與其對(duì)應(yīng)的含量(X，μg·mL-1)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。靛藍(lán)的回歸方程為：y=16.022x+21.742，R2=0.9994(n=3)，線性范圍：0～2 μg·mL-1；靛玉紅的回歸方程為：y=157.32x-9.3294，R2=0.9998(n=3)，線性范圍：0～10 μg·mL-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)生長(zhǎng)及生物量的影響

表1結(jié)果顯示，在不同硫素形態(tài)下菘藍(lán)生長(zhǎng)存在差異。其中NaHSO3和Na2SO4處理下菘藍(lán)株高顯著高于其他硫素形態(tài)處理，分別為25.46和24.80 cm。Na2S處理下菘藍(lán)苗株高最低，分別低于其他處理8.40%(CK)，21.69%(Na2SO4)，7.30%(Na2SO3)，23.72%(NaHSO3)，22.81% (Na2S2O3)。菘藍(lán)葉片鮮重以Na2SO4處理最高，其余處理依次為NaHSO3>CK>Na2SO3>Na2S2O3>Na2S。干重也以Na2SO4處理最高，分別高于其他處理66.67% (CK)，87.50%(Na2SO3)，18.81%(NaHSO3)，179.07%(Na2S)，64.38%(Na2S2O3)。綜合分析，以Na2SO4處理最有利于菘藍(lán)生長(zhǎng)及生物量的積累。

2.2 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)光合參數(shù)的影響

由表2可以看出，凈光合速率變化趨勢(shì)與水分利用效率基本一致，以NaHSO3處理下最高，且與其他處理呈顯著差異(P<0.05)。Na2SO4處理次之，而Na2S2O3處理處于最低水平。氣孔導(dǎo)度以NaHSO3處理最高，Na2S2O3次之，其余處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)。蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度變化存在一定的相似性，依次為NaHSO3>Na2S2O3>Na2SO3>Na2SO4>CK>Na2S。胞間CO2濃度變化與凈光合速率變化趨勢(shì)相反， NaHSO3處理下胞間CO2濃度最低，而凈光合速率最小的Na2S2O3處理的胞間CO2濃度最高。綜合分析NaHSO3處理最有利于菘藍(lán)葉片光合作用，Na2SO4處理次之。

表1 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)生長(zhǎng)及生物量的影響 Table 1 Effect of different sulfur forms on growth, leaf fresh and dry weight of I. indigotica (n=10)

注：表中數(shù)值后小寫(xiě)字母表示處理間差異達(dá)0.05顯著水平，下同。

Note：Values in the table followed by different letters are significant at 0.05 level, the same below.

表2 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)光合參數(shù)的影響 Table 2 Effect of different sulfur forms on photosynthetic parameters of I. indigotica (n=5)

2.3 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)光合色素的影響

從表3可知，不同形態(tài)硫素處理對(duì)菘藍(lán)苗期葉綠素總量和葉綠素a含量并無(wú)顯著影響(P>0.05)。葉綠素b含量以Na2S處理最高，分別高于其他處理58.97%(CK)，34.78%(Na2SO4)，51.22%(Na2SO3)，34.78%(NaHSO3)，58.97%(Na2S2O3)。而類胡蘿卜素以Na2S處理最低，與其余各處理差異顯著(P<0.05)，而其余處理間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)光合色素含量的影響 Table 3 Effect of different sulfur forms on photosynthetic pigment contents of I. indigotica (n=3) (mg·g-1)

2.4 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)氮代謝酶活性的影響

在不同硫素形態(tài)條件下， Na2SO3處理葉片中硝酸還原酶活性最高，與其他處理差異顯著(P<0.05)(表4)。CK和Na2SO4處理后硝酸還原酶活性相比于Na2SO3分別下降了20.44%和22.22%，兩者無(wú)顯著差異(P>0.05)。谷氨酰胺合成酶活性于對(duì)照處理(CK)下最高，分別高于其他處理34.39%(Na2SO4)，41.56%(Na2SO3)，61.50%(NaHSO3)，20.24%(Na2S)，23.34%(Na2S2O3)。谷氨酸脫氫酶以Na2SO4處理最低，且相較于其他處理，分別下降了1.48(CK)，2.24(Na2SO3)，0.60(NaHSO3)，2.66(Na2S)，3.79(Na2S2O3)倍。谷氨酸合成酶以Na2S處理最高，CK、Na2SO4、Na2S2O3次之，且3者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。SO32-形態(tài)的硫素(Na2SO3和NaHSO3)處理后谷氨酸合成酶活性最低。綜上發(fā)現(xiàn)，硫素形態(tài)對(duì)氮代謝酶活性影響沒(méi)有明顯的規(guī)律。

表4 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)氮代謝酶活性的影響 Table 4 Effect of different sulfur forms on nitrogen metabolism enzymes of I. indigotica (n=3)

2.5 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)硫代謝酶活性的影響

表5可以看出，不同形態(tài)的硫素對(duì)苗期菘藍(lán)葉片中硫代謝酶活性均以Na2SO4處理為最高(ATPS除外)，且顯著高于其他處理(P<0.05)。其中ATPS活性以CK處理最高，Na2SO4次之，但兩者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。Na2SO4處理分別比其他處理上升了85.79%(Na2SO3)，193.21%(NaHSO3)，47.25%(Na2S)，156.40%(Na2S2O3)。APR活性分別是其他處理的2.70(CK)，2.23(Na2SO3)，3.36(NaHSO3)，3.12(Na2S)，5.36(Na2S2O3)倍。OAS-TL活性在NaHSO3、CK和Na2S處理間差異不顯著，Na2SO3和Na2S2O3處理間差異不顯著。由此可見(jiàn)，以Na2SO4處理下菘藍(lán)葉片中硫代謝酶活性最強(qiáng)。

表5 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)硫代謝酶活性的影響 Table 5 Effect of different sulfur forms on sulfur metabolism enzymes of I. indigotica (n=3)

2.6 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

圖1結(jié)果顯示，不同形態(tài)硫素對(duì)苗期菘藍(lán)葉片中可溶性糖、游離氨基酸和可溶性蛋白含量的影響趨勢(shì)不同。其中可溶性糖含量以NaHSO3處理最高，與其他處理差異顯著(P<0.05)， Na2SO3和Na2SO4處理次之， CK、Na2S和Na2S2O3處理處于較低水平。施硫肥處理組游離氨基酸含量均高于無(wú)硫處理組(CK)。其中以Na2SO4處理下游離氨基酸含量處于最高水平。與游離氨基酸類似，可溶性蛋白含量于無(wú)硫處理下(CK)最低，相比于其他處理分別下降了56.07%(Na2SO4)，55.52%(Na2SO3)，81.94%(NaHSO3)，78.89%(Na2S)和79.72%(Na2S2O3)。其中NaHSO3處理的可溶性蛋白含量最高。

2.7 不同硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)中靛藍(lán)和靛玉紅含量的影響

不同形態(tài)硫素條件下菘藍(lán)葉片中活性成分含量變化與生理變化存在一定的差異(圖2)。靛藍(lán)和靛玉紅含量均以Na2S處理最高。其中靛藍(lán)含量以CK、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3處理次之，且之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，NaHSO3處理下靛藍(lán)含量最低，相比于Na2S處理下降了74.52%。而靛玉紅含量以Na2SO4和Na2SO3處理次之，且兩者無(wú)顯著差異(P>0.05)。Na2SO4和Na2SO3處理相比于Na2S處理含量下降了26.28%和32.30%。CK、NaHSO3和Na2S2O3處理下菘藍(lán)葉片靛玉紅含量較低。說(shuō)明S2-可以顯著促進(jìn)菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)和靛玉紅含量的累積。

3 討論

3.1 硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)生長(zhǎng)的影響

硫作為植物生長(zhǎng)的礦質(zhì)元素，是繼氮、磷、鉀后的第四大礦質(zhì)元素，是植物體內(nèi)酶化反應(yīng)活性中心的必需元素，也是植物體內(nèi)葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、輔酶等的組成成分[2]。在本研究中，以Na2SO4處理后菘藍(lán)株高、葉片鮮干重最高，說(shuō)明SO42-形式的硫素對(duì)于菘藍(lán)植物的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。 這可能與SO42-是植物體內(nèi)最主要的硫素吸收同化利用形式有關(guān)[2]。且在無(wú)硫條件下，菘藍(lán)植株生物量值僅低于Na2SO4和NaHSO3處理，并非處于最低水平。這與缺硫或低硫會(huì)在一定程度上抑制植物干物質(zhì)積累不一致[14]。推測(cè)原因可能是由于菘藍(lán)除通過(guò)根部吸收硫素外，還可通過(guò)葉片吸收空氣中SO2或H2S氣體來(lái)補(bǔ)充生長(zhǎng)所需的硫素。此外，不同硫素形態(tài)下?tīng)I(yíng)養(yǎng)液的pH值存在差異，其中CK和Na2SO4處理的營(yíng)養(yǎng)液呈中性，而NaHSO3處理下偏弱酸性，其余處理(Na2SO3、Na2S和Na2S2O3)呈弱堿性。本研究中硫素形態(tài)對(duì)菘藍(lán)生物量的影響排序?yàn)椋篘a2SO4>NaHSO3>CK>Na2SO3>Na2S2O3>Na2S。初步推斷，以中性或弱酸性環(huán)境較適宜于菘藍(lán)的生長(zhǎng)，而堿性環(huán)境可能會(huì)對(duì)菘藍(lán)生長(zhǎng)有一定的抑制作用。在實(shí)際栽培生產(chǎn)中，植物對(duì)硫素的吸收利用往往還受較多因素的影響，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)光合生理的影響

含硫化合物硫脂是植物光合作用過(guò)程中重要組分，硫脂是葉綠體內(nèi)一個(gè)固定的邊界膜。硫還是鐵氧還原蛋白的重要組分，在光合作用及氧化物的還原中起電子轉(zhuǎn)移作用[15]。因此，硫素對(duì)植物光合效率具有重要的作用。在本研究中，無(wú)硫處理下(CK)菘藍(lán)葉片中葉綠素含量最低，這可能與缺硫會(huì)導(dǎo)致植物葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，使正常的葉綠素合成代謝受到干擾相關(guān)。且菘藍(lán)在CK處理下凈光合速率同樣也處于相對(duì)較低的水平，這一方面與CK處理下葉片中葉綠素含量較低有關(guān)；另一方面也與缺硫?qū)е螺克{(lán)氣孔導(dǎo)度變小有關(guān)，使胞間二氧化碳濃度升高，從而限制了菘藍(lán)的凈光合速率[16]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)硫素處理下，菘藍(lán)的葉綠素含量顯著高于對(duì)照組，凈光合速率除Na2S2O3處理外也均高于CK處理。其中以Na2SO4與NaHSO3處理下菘藍(lán)的光合效率較高，這可能是由于不同形態(tài)的硫素在合成有機(jī)硫過(guò)程中存在一定的差異，而葉片中有機(jī)硫主要集中在葉肉細(xì)胞的葉綠體蛋白上[17]，從而使得不同硫素條件下菘藍(lán)的光合色素累積量與光合作用效率存在差異。

3.3 硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)氮、硫代謝的影響

在整個(gè)植物體硫同化過(guò)程中，不同的硫素存在于各自特定的階段。因此，不同硫素形態(tài)對(duì)植物體內(nèi)硫代謝酶活性有較大的影響。本研究中，Na2SO4處理下菘藍(lán)ATPS和APR活性較高，約為其他處理的兩倍。說(shuō)明SO42-形態(tài)的硫素會(huì)經(jīng)過(guò)活化氧化階段形成SO32-，從而促使ATPS及APR活性的提高。但無(wú)硫處理下(CK)的ATPS活性顯著高于硫素處理下(除Na2SO4處理外)，這與徐瑤等[8]發(fā)現(xiàn)施硫會(huì)提高白菜葉片中ATPS-2、ATPS-3、ATPS-4 表達(dá)量結(jié)論相反，這可能是因?yàn)椴煌参飳?duì)于硫素的吸收同化利用存在區(qū)別，且受包括遺傳因素和環(huán)境條件等共同影響[18]。植物半胱氨酸合成最后一步由2個(gè)酶共同催化完成，先由絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase, SAT)催化乙酰輔酶A和絲氨酸生成O-乙酰絲氨酸(O-Acetylserine, OAS)，然后H2S和OAS在OAS-TL的催化下形成半胱氨酸。不同形態(tài)硫素對(duì)于半胱氨酸合成酶的影響大?。篘a2SO4>NaHSO3>CK>Na2S>Na2SO3>Na2S2O3。這可能是由于在菘藍(lán)體內(nèi)，以SO42-形式的硫素同化途徑是主要的硫素利用方式，而其他形式的硫會(huì)對(duì)硫素同化過(guò)程形成一個(gè)反饋調(diào)控，且OAS-TL酶活性還受植物體內(nèi)OAS含量的影響，而OAS積累到一定程度時(shí)，會(huì)形成一個(gè)可逆的反應(yīng)系統(tǒng)[19]。因此OAS-TL對(duì)于不同硫素形態(tài)的響應(yīng)受多因素的影響。

植物中硫酸鹽同化和氮同化是互相協(xié)調(diào)的，一種元素的缺乏會(huì)抑制另一個(gè)元素的同化途徑。缺硫可能會(huì)導(dǎo)致N和C同化的抑制和氨基酸的積累[20]。朱英華等[21]研究發(fā)現(xiàn)硫素可以提高煙草(Nicotianatabacum)葉片中硝酸還原酶活性。朱云集等[22]研究發(fā)現(xiàn)高氮水平下施硫降低了小麥(Triticumaestivum)葉片中硝酸還原酶的活性，但提高了谷氨酰胺合成酶的活性。而Saccomani等[23]卻發(fā)現(xiàn)硫素對(duì)于玉米(Zeamays)中GS活性的影響不顯著。由此可見(jiàn)，氮代謝相關(guān)酶活性的強(qiáng)弱不僅受植物生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)狀況的影響，也可能與植物種類、光照、溫度、水分等多種環(huán)境因素有關(guān)[24]。無(wú)硫條件下菘藍(lán)葉片中谷氨酰胺合成酶活性最高，而硝酸還原酶活性是CK處理下較高。這可能與缺硫或者低硫條件促進(jìn)了氮代謝對(duì)同化能的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)[22,25]，硫素的缺失可以在一定程度上提高氮同化的競(jìng)爭(zhēng)力從而使硝酸鹽和銨的同化增強(qiáng)。而不同形態(tài)硫素對(duì)于菘藍(lán)的谷氨酸脫氫酶(GDH)活性的影響，以菘藍(lán)在堿性環(huán)境下(Na2S2O3，Na2S和Na2SO3)顯著高于中性或弱酸性環(huán)境(CK，NaHSO3和Na2SO4)。GDH具有雙重功能，既能催化NH4+與α-酮戊二酸合成谷氨酸，又能催化谷氨酸氧化脫NH4+[26-27]，推測(cè)可能是由于酸堿性環(huán)境影響植物體內(nèi)的NH4+含量變化，從而改變GDH酶活性，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4 硫素形態(tài)對(duì)苗期菘藍(lán)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及活性成分積累的影響

硫是組成蛋白質(zhì)的半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸等含硫氨基酸的重要組成成分，也是多種蛋白質(zhì)和酶的組分[28]。因此，硫素對(duì)菘藍(lán)體內(nèi)蛋白、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量有明顯的影響。無(wú)硫條件下(CK)菘藍(lán)葉中可溶性蛋白和游離氨基酸含量均處于最低水平，說(shuō)明缺硫會(huì)抑制其葉中氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。菘藍(lán)葉中蛋白和氨基酸含量對(duì)硫素形態(tài)的響應(yīng)基本呈現(xiàn)游離氨基酸含量高低與可溶性蛋白為相反趨勢(shì)(除Na2SO3處理外)，說(shuō)明不同硫素處理后，氨基酸與蛋白質(zhì)之間的合成與分解效率存在差異。而可溶性糖含量變化以S2-和S2O32-處理下含量較低，說(shuō)明該兩者形態(tài)的硫素對(duì)于可溶性糖的合成可能存在一定的抑制作用。

硫作為植物營(yíng)養(yǎng)元素之一，除對(duì)植物初生代謝產(chǎn)生影響外，對(duì)植物次生代謝也具有重要的作用。油菜(Brassicanapus)在缺乏硫素的情況下，芥子油苷含量顯著下降，一方面是因?yàn)楹铣蓽p少，另一方面為達(dá)到植物自身對(duì)硫的需求而促進(jìn)其分解[29]。靛藍(lán)、靛玉紅含量在無(wú)硫條件下均未最低，說(shuō)明在缺硫情況下，菘藍(lán)也可能通過(guò)其他途徑來(lái)平衡營(yíng)養(yǎng)元素的缺失或通過(guò)刺激次生代謝來(lái)抵御外界不良環(huán)境。此外，以S2-形式的硫素能顯著提高靛藍(lán)、靛玉紅含量。該現(xiàn)象不同于硫素形態(tài)對(duì)其生理、生長(zhǎng)等的影響，原因可能是在植物營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，植物資源分配存在差異，適宜的硫素形態(tài)使?fàn)I養(yǎng)較多地用于植株生長(zhǎng)，而在Na2S處理下，植物硫素資源更多轉(zhuǎn)向了次生代謝，這也是菘藍(lán)對(duì)不利環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制。在實(shí)際生產(chǎn)中，若是以獲取高含量提取靛藍(lán)、靛玉紅的藥材為栽培目的，可參考施以S2-形態(tài)的硫素。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下， Na2SO4處理后菘藍(lán)生長(zhǎng)狀況及生物量積累情況最佳，缺硫?qū)τ谳克{(lán)生長(zhǎng)抑制作用不顯著，CK處理下菘藍(lán)生物量高于其他硫素處理(除Na2SO4和NaHSO3外)。缺硫顯著降低了菘藍(lán)葉片中光合色素及光合效率，各硫素處理中，以Na2S處理下菘藍(lán)葉片中葉綠素含量最高，NaHSO3處理的光合效率最高。硫素的缺失及不同硫素形態(tài)對(duì)于菘藍(lán)葉片氮、硫代謝酶活性影響無(wú)明顯規(guī)律，其中以Na2SO3處理下NR活性最高，CK處理下GS活性最高，Na2S2O3處理下GDH最高，Na2SO4處理下GOGAT最高。對(duì)于硫代謝酶(ATPS，APR和OAS-TL)活性以Na2SO4處理下最高。缺硫能抑制可溶性蛋白和游離氨基酸的合成。其中可溶性糖和可溶性蛋白含量以NaHSO3處理下最高，而游離氨基酸以Na2SO4處理下最大。不同于初生代謝，菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)和靛玉紅含量均以Na2S處理最高。綜合不同硫素形態(tài)對(duì)于菘藍(lán)栽培品質(zhì)分析，以Na2SO4處理即SO42-形態(tài)的硫素最有利于菘藍(lán)的栽培。