OCT對冠狀動脈粥樣硬化及心肌梗死的法醫(yī)病理學(xué)輔助診斷

李洋，張寧，王成銘，何光龍

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)病理損傷技術(shù)處，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心 視頻偵查技術(shù)處，北京 100038；3.清華大學(xué)物理系，北京 100084）

在法醫(yī)影像學(xué)領(lǐng)域，目前的研究主要基于CT進(jìn)行人體三維重建開展死后虛擬解剖。虛擬解剖能夠在短時間內(nèi)對尸體進(jìn)行全身檢查，作出影像學(xué)診斷，在分析顱腦損傷、高墜及其他常規(guī)解剖難以發(fā)現(xiàn)機(jī)體損傷的案件中發(fā)揮著重要作用[1]。但是，基于CT技術(shù)的虛擬解剖，其限制在于平臺要求高，重建時間長，對操作者有一定放射傷害，分辨率較光學(xué)顯微鏡低，無法發(fā)現(xiàn)微米級的病變結(jié)構(gòu)和組織，因此對于組織器官顯微結(jié)構(gòu)的影像觀察仍然依賴傳統(tǒng)法醫(yī)病理學(xué)技術(shù)[2]。傳統(tǒng)法醫(yī)病理學(xué)技術(shù)主要對尸體、離體器官組織進(jìn)行系統(tǒng)解剖，從而解釋死亡原因、死亡時間、損傷時間、致傷物推斷等問題。通常情況下，法醫(yī)病理學(xué)家需要通過對不同器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢驗(yàn)，才能對死亡原因等問題做出正確的鑒定。經(jīng)典的組織病理學(xué)檢查是利用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色方法，在顯微鏡下觀察細(xì)胞水平上的變化，從而提高法醫(yī)病理學(xué)家對疾病或者損傷的診斷準(zhǔn)確性。但是，病理切片制作過程復(fù)雜，對操作水平要求較高，人為假象、死后腐敗等因素也會干擾法醫(yī)病理學(xué)取材，對病理切片的結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）是近年出現(xiàn)的一種新型光學(xué)影像技術(shù)，其成像特點(diǎn)是對機(jī)體無損傷，無需接觸即可獲得具有極高空間分辨率的二維圖片，并能進(jìn)一步形成三維斷層體成像，目前，OCT已開始應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，并取得良好效果，如檢查眼球結(jié)構(gòu)、冠狀動脈管腔等[3-4]。而在法庭科學(xué)領(lǐng)域，ZHANG等[5]指出OCT對不同品牌汽車油漆有較好的辨識度，有望成為交通事故現(xiàn)場快速檢驗(yàn)的技術(shù)手段。目前，已有法醫(yī)學(xué)者開始研究OCT在法醫(yī)病理學(xué)中的應(yīng)用價值。NAPOLI等[6]指出，在動物實(shí)驗(yàn)中可利用OCT檢測眼角膜的厚度進(jìn)而推斷死亡時間。BROWN等[7]通過觀察OCT圖像中蠅類蟲蛹發(fā)育程度而推斷死亡時間。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察OCT橫切面圖像與傳統(tǒng)HE染色組織病理學(xué)切片的異同，以明確OCT在人體組織的成像特點(diǎn)，初步探索該技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

OCT系統(tǒng)（自主搭建[5]），ShandonTMExcelsiorTMES組織脫水機(jī)、HistoStarTM組織包埋機(jī)、ShandonTMFinesseTME+石蠟切片機(jī)、VaristainTMGemini ES自動玻片染色機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Infinity2-3（美國Lumenera公司），Image-Pro Plus?6.0.0.260軟件（美國Media Cybernetic公司），多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木素（美國Thermo Fisher Scientific公司）和伊紅（北京九州柏林生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

本次實(shí)驗(yàn)樣本來源于公安部物證鑒定中心及北京市公安局法醫(yī)中心5名男性，死亡原因鑒定意見均為冠心病急性發(fā)作猝死，大體器官及組織病理學(xué)檢驗(yàn)均可見左、右冠狀動脈粥樣硬化病理學(xué)改變。本研究分別采集每具尸體的心臟左右冠狀動脈粥樣硬化病變橫斷面、左心室前壁陳舊性心肌梗死橫斷面和正常心肌組織各1份，實(shí)驗(yàn)樣本取材約為1.5 cm×1.5 cm×2.0mm。

1.3 OCT操作流程及相關(guān)參數(shù)

本研究中OCT系統(tǒng)深度分辨率約6 μm，橫向分辨率約7 μm，線掃描速率為70 kHz。系統(tǒng)使用寬帶超輻射發(fā)光二極管（superluminescent light-emitting diode，SLD）近紅外光源，中心波長為832 nm，譜帶半高全寬60.4 nm，輸出功率13 mW。曝光時間設(shè)置為15μs，系統(tǒng)信噪比約96dB。樣品的橫向掃描由樣品臂的一組掃描振鏡實(shí)現(xiàn)。振鏡與圖形采集保持同步。圖像采集、處理和顯示均由基于C++自主開發(fā)的軟件進(jìn)行。三維圖像渲染由Visage ImagingTMAmira?5.3.3軟件（澳大利亞Visage Imaging公司）實(shí)現(xiàn)。

OCT操作過程：使用脫脂紗布將實(shí)驗(yàn)樣本表面水分擦干，用解剖刀修平表面，將樣本放在OCT系統(tǒng)掃描平臺上，打開光源和振鏡，開啟數(shù)據(jù)采集軟件，設(shè)置電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）積分時間為15 μm，掃描范圍6 mm×6 mm。定位掃面區(qū)域后，開啟采集按鈕對樣本表面進(jìn)行掃描，即得到OCT圖像，采集時間0.5～1min。

1.4 組織病理學(xué)檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)樣本浸沒于4%多聚甲醛-PBS液室溫固定24h后，進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)脫水、浸蠟、包埋組織切片過程。以5 μm厚度連續(xù)切片，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)HE染色，中性樹脂封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，利用Infinity2-3截取視野圖像。

1.5 測量指標(biāo)

利用Adobe Photoshop CS6（美國Adobe公司）隨機(jī)測量10張OCT圖像、利用Infinity2-3測量10張組織病理切片中的動脈粥樣硬化灶纖維帽、中膜厚度及脂質(zhì)池數(shù)量。

使用Image-Pro Plus?6.0.0.260軟件對正常心肌與陳舊性心肌梗死區(qū)各5張OCT圖像分別進(jìn)行不同區(qū)域相同面積的累積光密度值（integrated optical density，IOD）測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

通過形態(tài)學(xué)方法比較不同程度冠狀動脈粥樣硬化（Ⅰ級和Ⅳ級）[8]，心肌梗死病灶各結(jié)構(gòu)在OCT圖像和光學(xué)顯微鏡上的異同。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，使用SPSS 22.0軟件對纖維帽、中膜厚度、脂質(zhì)池數(shù)量進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)，對正常心肌與陳舊性心肌梗死病灶的IOD值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅰ級冠狀動脈粥樣硬化

光學(xué)顯微鏡（圖1A～B）能較好地區(qū)分管壁三層結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)膜增厚，可見纖維增生及泡沫細(xì)胞等粥樣硬化早期病理學(xué)改變。

OCT圖像（圖1C～D）中，冠狀動脈中膜、外膜分層較清晰，并能清楚顯示內(nèi)膜表面的纖維帽結(jié)構(gòu)，此外內(nèi)膜中可見光密度較低的增生纖維組織，內(nèi)膜出現(xiàn)不連續(xù)性病理改變。

圖1 Ⅰ級冠狀動脈粥樣硬化

2.2 Ⅳ級冠狀動脈粥樣硬化

光學(xué)顯微鏡（圖2A～B）下，冠狀動脈內(nèi)膜明顯增厚，粥樣斑塊形成并向管腔膨出。斑塊中可見灶性中性粒細(xì)胞浸潤，底部可見膽固醇結(jié)晶裂隙及無結(jié)構(gòu)的粥樣物質(zhì)。

OCT圖像（圖2C～D）可見，管腔狹窄嚴(yán)重，粥樣斑塊向管腔增生，斑塊中無定形物質(zhì)的光密度呈不均勻結(jié)構(gòu)。病變嚴(yán)重區(qū)域的中膜彈力纖維變薄。管腔中的血凝塊組織呈強(qiáng)光反射性。

圖2 Ⅳ級冠狀動脈粥樣硬化

2.3 心肌梗死灶

光學(xué)顯微鏡（圖3A）下可見陳舊梗死灶，表現(xiàn)為大量纖維瘢痕組織替代正常心肌，在纖維結(jié)締組織中血管明顯淤血（圖3B）。纖維組織與正常心肌組織界限較明顯，可見部分纖維組織插入周圍正常心肌中。

OCT圖像（圖3C）中正常心肌組織光信號較弱，呈高吸光性，而心肌梗死區(qū)纖維瘢痕組織內(nèi)則顯示出較強(qiáng)光信號，呈低吸光性，正常心肌與陳舊心肌梗死區(qū)有較明顯的界限。此外，纖維組織中的血管呈高吸光性。淤血的血管與纖維結(jié)締組織有較好的辨識度（圖3D）。

2.4 其他組織

此外，我們通過對比心外膜OCT與HE圖像發(fā)現(xiàn)：OCT圖像中神經(jīng)組織與血管中凝血塊均呈低吸光性，而脂肪細(xì)胞OCT圖像中能明顯區(qū)分細(xì)胞膜及內(nèi)部脂滴（圖4）。

2.5 測量指標(biāo)比較

分別測量OCT圖像和光學(xué)顯微鏡圖像上冠狀動脈粥樣硬化病灶處纖維帽和中膜的厚度，OCT圖像中冠狀動脈粥樣硬化灶纖維帽厚度平均為（55.24±25.08）μm，光學(xué)顯微鏡圖像上纖維帽厚度為（77.30±98.25）μm，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.493）。OCT與HE圖像中的中膜厚度分別為（74.77±31.21）μm、（89.78±68.68）μm，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.451）。OCT與HE圖像中的脂質(zhì)池數(shù)量均為7個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

正常心肌組織的IOD值（3 707.90±962.98）與陳舊性心肌梗死區(qū)的IOD值（1 226.24±622.66）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 左心室前壁心肌梗死灶

圖4 心外膜下組織

3 討 論

在鑒定冠心病急性發(fā)作導(dǎo)致的猝死案件過程中，如果法醫(yī)病理學(xué)專家能借助輔助技術(shù)手段在尸體檢驗(yàn)時快速、準(zhǔn)確地取到病變組織并進(jìn)行組織病理學(xué)檢驗(yàn)，一方面能縮短法醫(yī)病理鑒定時間，另一方面也能為診斷提供輔助依據(jù)。

OCT作為一種新興影像學(xué)技術(shù)已被臨床學(xué)者用于指導(dǎo)冠心病早期預(yù)防、治療及預(yù)后過程。例如，KUME等[9]在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，OCT技術(shù)可以對活體冠狀動脈病變的程度進(jìn)行有效評估，其圖像的分辨率優(yōu)于目前臨床B超的結(jié)果。因?yàn)榫哂懈叻直媛?、?shí)時、穿透組織等特點(diǎn)，利用OCT可對組織進(jìn)行簡便、快捷、直觀的光學(xué)影像觀察，這在法醫(yī)病理學(xué)快速篩查、初步診斷方面無疑是有一定應(yīng)用價值的。ADLAM等[10]指出，OCT有希望成為一種對尸體損傷較小的診斷心臟性猝死的工具，遺憾的是ADLAM沒有討論OCT圖像與光學(xué)顯微鏡圖像之間的對應(yīng)關(guān)系。而本研究結(jié)果顯示，OCT圖像與光學(xué)顯微鏡下HE圖像在動脈粥樣硬化病理特征，包括粥樣硬化斑塊、內(nèi)膜纖維帽及內(nèi)膜厚度變化等方面都有較好的相關(guān)性。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，判斷血管內(nèi)血栓成因?qū)λ篮蠹膊≡\斷有重要價值。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在OCT圖像中，血管中的凝血塊呈現(xiàn)不同程度的光密度值。根據(jù)KUME等[11]的進(jìn)一步研究，血栓成分不同可造成OCT圖像上血凝塊亮度上的不同。基于KUME等及本研究的結(jié)果，認(rèn)為法醫(yī)病理學(xué)者可以利用OCT技術(shù)輔助區(qū)分血栓類型。

同時，本研究結(jié)果顯示，OCT圖像上正常心肌與陳舊性心肌梗死區(qū)之間存在明顯的界限，其原因可能為：相比正常心肌組織，纖維瘢痕較致密，對可見光、近紅外光具有較強(qiáng)的反射、散射能力。此外，正常心肌和陳舊性心肌病灶區(qū)的IOD值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果都說明，OCT圖像能有效地辨識正常心肌組織和陳舊性心肌病灶。此外，在OCT影像中，除了冠狀動脈各層、心肌、纖維瘢痕等組織，神經(jīng)、脂肪組織在OCT圖像與光學(xué)顯微鏡圖像中也有良好對應(yīng)關(guān)系，這些表明，OCT能夠反映出HE染色結(jié)果。

本研究證明，OCT技術(shù)可在心臟大體檢驗(yàn)時進(jìn)行病理組織學(xué)的初篩，輔助法醫(yī)病理學(xué)專家對冠狀動脈粥樣硬化、心肌纖維化程度進(jìn)行預(yù)判，有針對性地取材，以利于下一步工作。而對于其他重要器官，如腦、肺、腎等，OCT技術(shù)是否同樣能夠反映出組織病理改變?nèi)孕枰M(jìn)一步研究。