姜黃素對甲狀腺乳頭狀癌TPC?1細(xì)胞侵襲和遷移的影響

孫麗靜，房 輝，楊 瑩，王路廣，王向楠，南欣雨，于敬坤，郝向波，吳明昊

0 引 言

甲狀腺癌是全球最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。20世紀(jì)80年代，甲狀腺癌在人類所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快［2］。甲狀腺乳頭狀癌（papil?lary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%～85%，且以女性多見［3］。隨著臨床檢測技術(shù)不斷提升，大部分PTC患者可獲得早期診斷和臨床治療，預(yù)后良好，病死率低［2－3］。 但PTC常出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加局部復(fù)發(fā)和癌癥特異性死亡。因此，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是潛在致命的首要標(biāo)志［3－4］。 當(dāng)前，PTC 臨床治療手段包括手術(shù)切除、放射性治療 I131、藥物化療或聯(lián)合治療［4］。盡管多數(shù)PTC患者可通過手術(shù)治療，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多見，易出現(xiàn)晚期和復(fù)發(fā)型PTC，造成手術(shù)切除困難、碘劑耐受、放化療敏感性差，缺乏有效治療措施［5］。因此，尋求新型抗 PTC藥物成為重點(diǎn)。天然藥物具有藥效廣泛、毒性低、價格低廉等特點(diǎn)，已成為抗癌藥物研究的重要領(lǐng)域。姜黃素屬于多酚類化合物，從姜黃根莖中提?。?］。已有研究表明，姜黃素在人類多種腫瘤中具有抑制侵襲和遷移的作用，但姜黃素對PTC的細(xì)胞株TPC?1的侵襲和遷移影響研究甚少［7］。本研究用姜黃素干預(yù)PTC的TPC?1細(xì)胞，觀察對細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose trans?porter， Glut1）、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶?1（member type?1 matrix metalloprotehnases， MT1?MMP）mRNA及蛋白表達(dá)的變化，探討姜黃素對PTC可能的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞株：人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC?1，由華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院惠贈。胎牛血清（FBS）（Cegrogen 公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)（CORNI?NG公司）；姜黃素（美國Sigma公司）用DMSO溶解配制母液，DMSO在含藥培養(yǎng)基中終濃度＜0.1%；Glut1、MT1?MMP 和 β?actin的一抗（Arigo公司）；羊抗兔、羊抗鼠的二抗（北京中杉金橋公司）；CCK8試劑盒（莊盟生物）；Matrigel膠（美國 BD公司）；Glut1、MT1?MMP 和 GAPDH 引物（Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT?PCR熒光試劑盒（莊盟生物）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將TPC?1細(xì)胞接種于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長1～2 d，胰蛋白酶消化傳代，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK8 實(shí)驗(yàn)將 TPC?1 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104／mL，接種到96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別給予含不同姜黃素濃度的培養(yǎng)基干預(yù)，分為：0 μmol／L 組（DMSO 溶劑）、10、20、40、60、80、100 μmol／L 組， 24、48 h 后，每孔貼壁加入CCK8 10μL，培養(yǎng)箱中靜置4h。采用全自動定量繪圖酶標(biāo)儀測量490 nm波長處各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率計算公式如下，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)將TPC?1細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合狀態(tài)時，用200μL移液槍槍頭在板底劃直線，此過程要保持槍頭與板底垂直。用PBS液輕輕清洗3次，沖掉脫落的細(xì)胞碎片，加入含不同姜黃素濃度的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察0、24、48h細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)采用無血清培養(yǎng)基重懸TPC?1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 4×105／mL。 Matrigel放置于冰上，與預(yù)冷的無血清1640培養(yǎng)液按1∶9稀釋，每孔加入50 μL稀釋好的Matrigel鋪入24孔板的上層小室，置于培養(yǎng)箱中溫育5h。在上層小室加入200μL細(xì)胞懸液及不同濃度的姜黃素，設(shè)立對照。下層小室加入600μL含30%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄上層小室培養(yǎng)液，PBS清洗3次，棉簽拭去未穿過小室的細(xì)胞，5%多聚甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計染色遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5 RT?PCR不同濃度的姜黃素干預(yù) TPC?1 細(xì)胞24h后，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 Glut1 上 游 引 物： 5′?TGGCATCAACGCT?GTCTTCT?3′，下游引物：5′?CTAGCGCGATGGTCAT?GAGT?3′；MT1?MMP 上游引物：5′?ATCTGCCTCTGC?CTCACCTA?3′，下游引物：5′?AAGCCCCATCCAAG?GCTAAC?3′；GAPDH 上游引物：5′?GAAAGCCTGC?CGGTGACTAA?3′下 游 引 物： 5′?AGGAAAAGCAT?CACCCGGAG?3′。 RT?PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 ～ 3 min；94℃15s，60℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。 使用SYBR Green熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機(jī)分析CT值。以GAPDH為內(nèi)參基因，計算公式如下：

計算2－ΔΔCT，即為待測基因與管家基因的相對定量，其中實(shí)驗(yàn)組為 0、10、20、40 μmol／L 組，對照組為0μmol／L 組。

1.2.6 Western blot分析不同濃度的姜黃素處理TPC?1細(xì)胞24h后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液后冰上靜置30 min，4℃，12000 r／min離心15min，取上清液。BCA法蛋白定量后，進(jìn)行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入1∶2000稀釋的兔抗人Glut1抗體，1∶1500稀釋的兔抗人 MT1?MMP 抗體及 1∶5000稀釋的鼠抗人β?actin抗體，4℃過夜雜交，TBST清洗后，分別加入1∶5000稀釋的山羊抗兔IgG和1∶2000稀釋的山羊抗鼠IgG，室溫溫育2h。TBST清洗后行進(jìn)化ECL顯色檢測蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均值比較采用重復(fù)測量分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對 TPC?1 細(xì)胞增殖的影響24、48 h，各組間細(xì)胞存活率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。除0μmol／L組外，其余各組48 h時TPC?1細(xì)胞存活率較24h明顯降低（P＜0.05）。表明姜黃素隨著劑量增加，作用時間延長，細(xì)胞存活率越低。見表1。由于高濃度姜黃素處理細(xì)胞后，細(xì)胞大部分死亡飄離培養(yǎng)皿。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用 0、10、20、40μmol／L 組。

表1 姜黃素干預(yù)TPC?1細(xì)胞后細(xì)胞存活率的比較（±s，%）Table 1 Viability of the TPC?1 cells after treated with dif?ferent concentrations of curcumin for 24 and 48 hours（±s，%）

表1 姜黃素干預(yù)TPC?1細(xì)胞后細(xì)胞存活率的比較（±s，%）Table 1 Viability of the TPC?1 cells after treated with dif?ferent concentrations of curcumin for 24 and 48 hours（±s，%）

相同時間點(diǎn)組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與組內(nèi)24h 比較，?P＜0.05

組別 細(xì)胞存活率24h 48h 0μmol／L 組 100.0±0.0 100.0±0.0 10μmol／L 組 85.5±3.0 77.3±1.4?20μmol／L 組 71.9±4.3 56.7±2.7?40μmol／L 組 53.9±2.2 41.4±2.3?60μmol／L 組 43.2±6.3 25.2±1.8?80μmol／L 組 38.7±5.9 20.6±2.0?100μmol／L 組 23.9±3.8 8.1±0.8?

2.2 姜黃素對TPC?1細(xì)胞遷移的影響藥物干預(yù)24、48h后，組間TPC?1細(xì)胞遷移比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 組內(nèi) TPC?1 細(xì)胞遷移比較，0μmol／L組48、24、0h兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 10μmol／L 組 48、24 h 與 0 h 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 20、40 μmol／L 組組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖 1，表 2。

圖1 不同濃度姜黃素干預(yù)后TPC?1細(xì)胞的遷移情況（×40）Figure 1 Migration of the TPC?1 cells at different time points after treated with different concentrations of curcumin （ ×40）

表2 姜黃素干預(yù)后TPC?1細(xì)胞的遷移情況（x ±s，mm）Table 2 Migration of the TPC?1 cells at different time points after treated with different concentrations of curcumin（x ±s，mm）

2.3 TPC?1 細(xì)胞侵襲力0、10、20、40μmol／L 組穿過的細(xì)胞數(shù)量分別為 196、142、57、17個／100 倍視野。組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明姜黃素降低細(xì)胞侵襲力具有劑量依賴性。見圖2。

圖2 不同濃度姜黃素干預(yù)TPC?1細(xì)胞后穿膜細(xì)胞數(shù)量（×100）Figure 2 Number of the TPC?1 cells that penetrated the cell membrane after treated with different con?centrations of curcumin （ ×100）

2.4 姜黃素對 TPC?1 細(xì)胞 Glut1 和 MT1?MMP mRNA和蛋白表達(dá)的影響各組間Glut1和MT1?MMP mRNA相對表達(dá)量及蛋白量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 表明姜黃素干預(yù) TPC?1細(xì)胞后，Glut1和MT1?MMP mRNA相對表達(dá)量、蛋白量均下調(diào)，呈劑量依賴性。見表3，圖3。

表3 姜黃素干預(yù)TPC?1細(xì)胞24h后Glut1和MT1?MMP mRNA及蛋白的相對表達(dá)量Table 3 Expressions of Glut1 and MT1?MMP in the TPC?1 cells after treated with different concentrations of curcumin for 24 hours

圖3 不同濃度姜黃素對Glut1和MT1?MMP蛋白的影響Figure 3 Protein expressions of Glut1 and MT1?MMP in the TPC?1 cells after treated with different con?centrations of curcumin

3 討 論

目前，甲狀腺癌在我國的臨床流行病學(xué)特點(diǎn)是患者數(shù)量增加，早期患者比例加大，以乳頭狀癌為主，且發(fā)病率和病死率逐年上升趨勢［8－10］。 PTC 患者整體10年存活率＞90%。然而，10年的隨訪中發(fā)現(xiàn)，伴有廣泛轉(zhuǎn)移的PTC僅有60%的存活率。因此，PTC轉(zhuǎn)移給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)［6］。

姜黃素產(chǎn)于東南亞，隸屬于姜科家族，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗癌、抗肝纖維化和動脈粥樣硬化等，毒性低、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)［11］。姜黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，減少瘤體數(shù)量，減慢瘤體的增長，從多個環(huán)節(jié)和步驟發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［12－13］。 本研究 CCK8結(jié)果表明，姜黃素以時間和劑量依賴的方式抑制TPC?1細(xì)胞增殖。劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制TPC?1細(xì)胞的遷移和侵襲力。

腫瘤常發(fā)生代謝改變，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取增加，有氧糖酵解活性增強(qiáng)，稱為瓦博格效應(yīng)［14］。Glut1幾乎在機(jī)體所有細(xì)胞中均有表達(dá)，但在人類多種腫瘤中過度表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素，也是瓦博格效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白［15］。研究表明，Glut1高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)和預(yù)后不良相關(guān)［16］。干擾Glut1功能能夠造成惡性細(xì)胞能量缺乏而死亡，可能成為治療的靶點(diǎn)。已有報道，Glut1在PTC中表達(dá)增加，對預(yù)后具有指示意義，需要積極治療［16－17］。 因此，本研究用姜黃素干預(yù)TPC?1細(xì)胞后，檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)Glut1的變化，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，蛋白下降的越明顯，細(xì)胞遷移和侵襲減弱，腫瘤細(xì)胞惡性行為下降。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜生物學(xué)過程，癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落后，需要與細(xì)胞基質(zhì)黏附、遷移，突破基底膜組成的屏障結(jié)構(gòu)，才能向周圍組織浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［18］。

MT1?MMP是首個鑒定的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶類，也是MMPs中唯一的膜錨定酶。MT1?MMP參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解和重塑、促進(jìn)腫瘤血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附等多方面發(fā)揮作用，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵酶［19］。MT1?MMP可與金屬蛋白酶組織抑制劑?2（TIMP?2）和酶原 MMP?2（pro?MMP?2）形成三分子聚合體，激活 pro?MMP?2，同時激活 pro?MMP?9、13，增加對 ECM 的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［20］。MT1?MMP在PTC中表達(dá)增加，且與包膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［21］。研究顯示，Glut1 為 MT1?MMP 的上游蛋白，Glut1、MT1?MMP在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用［22］。在大多數(shù)腫瘤中，Glut1和MT1?MMP高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，對疾病預(yù)后評估有重要提示意義，可能成為治療靶點(diǎn)［23－24］。 因此，為了探究姜黃素抑制 TPC?1 細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制，本研究檢測了細(xì)胞內(nèi)Glut1和MT1?MMP mRNA和蛋白表達(dá)的變化。RT?PCR和Western blot結(jié)果顯示，Glut1和 MT1?MMP mRNA 和蛋白表達(dá)隨姜黃素濃度的增加而呈下降趨勢，表現(xiàn)為劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上，姜黃素能夠降低Glut1和MT1?MMP蛋白表達(dá)，抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC?1細(xì)胞侵襲和遷移，為PTC患者治療提供新的思路。本研究不足之處在于，未能直接從基因角度靶向抑制蛋白表達(dá)，觀測細(xì)胞生物惡性行為變化，此后我們將從基因角度進(jìn)行深入研究。