非小細(xì)胞肺癌甲醛固定石蠟包埋切片DNA再利用的可行性研究

魏 雪，葉勝兵，王 璇，吳 楠，章如松，馬恒輝，饒 秋

0 引 言

肺癌的發(fā)病率和病死率逐年攀升，現(xiàn)已躍居惡性腫瘤之首。肺癌患者中80%以上為非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC），且確診時(shí)約60%為晚期患者［1］。盡管在化療、放療等綜合治療手段上有很大改進(jìn)，但總體療效已達(dá)瓶頸，5年生存率仍低于20%［2-4］。近年來(lái)針對(duì)EGFR的靶向藥物已經(jīng)成功應(yīng)用于NSCLC治療，很大程度上延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間和改善生活質(zhì)量。部分肺癌晚期患者由于獲取標(biāo)本較為困難，有限的標(biāo)本大多被用于前期常規(guī)染色及免疫組化染色，而無(wú)法進(jìn)行相關(guān)分子檢測(cè)，進(jìn)而影響患者的藥物治療。甲醛固定石蠟包埋（formalin?fixed paraff?nembedded，F(xiàn)FPE）是病理科普遍采用的組織處理和保存方法。該操作由于流程簡(jiǎn)單，易于掌握，可實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化處理，且代價(jià)低廉，目前廣泛應(yīng)用于病理科的常規(guī)工作中。免疫組化染色是臨床病理診斷中最普遍且不可替代的輔助診斷技術(shù)。對(duì)于再利用免疫組化染色后的切片重新提取DNA并用于后續(xù)基因相關(guān)檢測(cè)的可行性研究國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)NSCLC患者FFPE標(biāo)本經(jīng)免疫組化染色后的DNA進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并進(jìn)行后續(xù)分子檢測(cè)，以期探討標(biāo)本回收利用的可行性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采用完全隨機(jī)法選取2017年6月至2017年12月于我院就診且病理診斷為NSCLC的FFPE標(biāo)本50份。每份標(biāo)本分別切片12張，厚度3μm。隨機(jī)抽取其中6張切片作為對(duì)照組直接進(jìn)行DNA提?。皇Ｓ嗲衅{入實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行免疫組化染色后進(jìn)行DNA提取，并對(duì)所有提取DNA進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）基因以及鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌基因同源體B1（V?raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）基因突變檢測(cè)。

1.2 儀器及試劑免疫組化染色試劑（TTF?1、P63、NapsinA、CK5/6、Syn、P40）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒為QlAamp DNA FFPE Tissue Kit（QIAGEN）；ARMS法EGFR、KRAS、BRAF檢測(cè)試劑盒由廈門(mén)艾德公司提供；ARMS法擴(kuò)增采用ABI7500熒光PCR儀。

1.3 免疫組化染色免疫組化采用EnVision兩步法染色，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。陽(yáng)性結(jié)果判斷嚴(yán)格按照組織學(xué)檢測(cè)相同的定位、定性要求進(jìn)行。

1.4 切片處理及DNA抽提嚴(yán)格按照Qlamp DNA FFPE Tissue Kit操作說(shuō)明進(jìn)行提取。①脫蠟：實(shí)驗(yàn)組的FFPE切片浸入二甲苯中直至蓋玻片自然脫落（室溫約2d），無(wú)水乙醇漂洗，室溫風(fēng)干，刮片收集組織；對(duì)照組FFPE切片直接以二甲苯脫蠟無(wú)水乙醇漂洗，風(fēng)干后進(jìn)行刮片收集組織。將玻片進(jìn)行二甲苯脫蠟，再以無(wú)水乙醇漂洗，風(fēng)干后刮取1.5mL裝入EP管中。②酶解：加入200μL消化液及20μL蛋白酶K混勻，56℃酶解過(guò)夜。③結(jié)合：加入200μL結(jié)合液混勻，再加入200μL無(wú)水乙醇混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，以8000×g離心力離心1min，棄廢液。④洗滌：分別用預(yù)先配制的洗滌液洗滌，棄廢液，將吸附柱轉(zhuǎn)移后以12 000×g離心力離心5 min。⑤洗脫：將吸附柱轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，加入100μL的洗脫液，室溫靜置1min，以12 000×g離心力離心1min，將收集的洗脫液（即DNA提取液）進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，-80℃保存待用。

1.5 DNA測(cè)定嚴(yán)格按照標(biāo)本質(zhì)量控制試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增EGFR第18、19、20、2l外顯子，KRAS第 12、13密碼子和BRAF第600密碼子。所得到的PCR產(chǎn)物取1μL加入 0.5μL GenesScan 500 LIZ Size Strand，再加入10μL的 Hi-Di Fromamide，以 6000×g離心力離心30s。在PCR儀上進(jìn)行變性（95°C變性 5min，4℃5min），基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，標(biāo)本應(yīng)在100、200、300、395bp位置收集到 ROX 熒光信號(hào)，則表示標(biāo)本為合格。

1.6 ARMS法檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將提取的DNA稀釋為2ng/μL，按42.3μL稀釋的DNA模板加2.7μLTaq酶液混合，每反應(yīng)5μL分裝到預(yù)先分裝的8聯(lián)管反應(yīng)液中，以6000×g離心力離心30s，用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5min；95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20 s，共 15 個(gè)循環(huán)；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃20s，共31個(gè)循環(huán)；后31個(gè)循環(huán)60℃收集FAM和VIC信號(hào)并數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較DNA濃度及純度差異；應(yīng)用四個(gè)表一致性檢驗(yàn)分析組間EGFR、KRAS、BRAF基因突變檢測(cè)結(jié)果。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA濃度及純度實(shí)驗(yàn)組提取DNA濃度（80.84±35.13）及純度（1.90±0.08）分別與對(duì)照組［（85.03±36.64）和（1.92±0.06）］比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖 1。

2.2 ARMS法檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中檢測(cè)到EGFR基因突變20例（40%）。其中第18號(hào)外顯子突變2例（10%）、第19號(hào)外顯子突變15例（75%）、第20號(hào)外顯子突變1例（5%）、第21號(hào)外顯子突變2例（15%）。EGFR基因突變主要集中在19號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子點(diǎn)突變（L858R），見(jiàn)圖2；實(shí)驗(yàn)組共檢測(cè)到KRAS基因突變8例（16%）。其中第12密碼子突變7例（87.5%）、第 13密碼子突變 1例（12.5%），見(jiàn)圖3；實(shí)驗(yàn)組共檢測(cè)到BRAF基因V600E點(diǎn)突變5例（10%），見(jiàn)圖4。對(duì)照組NSCLC FFPE切片中，33份分別檢測(cè)出相應(yīng)的EGFR、KRAS和BRAF基因突變；另外17份同樣檢測(cè)出陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性，結(jié)果相比符合率達(dá) 100%（P=0.000）。

圖1 DNA抽提結(jié)果Figure 1 Results of DNA extraction from the FFPE specimens of NSCLC

圖3 KRAS檢測(cè)結(jié)果示KRAS 12位密碼子突變Figure 3 Mutation of KRAS in the FFPE specimens of NSCLC

圖4BRAF檢測(cè)結(jié)果示BRAF陽(yáng)性Figure 4 Mutation of KRAS in the FFPE specimens of NSCLC

3 討 論

肺癌相關(guān)的死亡仍然是全球癌癥病死率最高的疾病之一［5］。其中NSCLC占肺癌死亡的80%～85%。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)和人類基因組學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)肺癌病變與侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理以及生物信號(hào)傳導(dǎo)通路的認(rèn)識(shí)有了進(jìn)一步的加深，從而為肺癌的早期診斷和開(kāi)發(fā)新的治療方法提供了機(jī)會(huì)。分子標(biāo)志物檢測(cè)是個(gè)體化治療的前提，目前肺癌分子靶向治療常用的治療靶點(diǎn)包括細(xì)胞受體、信號(hào)傳導(dǎo)和抗血管生成等。近年來(lái)出現(xiàn)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑（如吉非替尼）備受關(guān)注。KRAS基因突變與非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)EGFR?TKI靶向藥物的原發(fā)性耐藥有關(guān)［6］。BRAF基因作為一種原癌基因編碼絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼對(duì)存在EGFR基因突變的患者有較好的療效，但存在KRAS和BARF基因突變的患者對(duì)吉非替尼表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象。因此，EGFR、KRAS、BRAF基因檢測(cè)是NSCLC患者最常用的檢測(cè)指標(biāo)。

免疫組化利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)，主要定位一些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)的存在。ARMS法檢測(cè)是一項(xiàng)在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新方法，利用特異引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴(kuò)增放大，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品DNA中稀有突變的檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)基因突變檢測(cè)的高特異性和靈敏度。與ARMS法比較，免疫組化使用抗體的檢測(cè)對(duì)象為抗原，機(jī)制是抗原-抗體的特異性結(jié)合，是蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)；ARMS法使用的是熒光探針，利用探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，是DNA水平的檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化后再進(jìn)行后續(xù)基因檢測(cè)并不影響其檢測(cè)仍可以獲得高質(zhì)量的結(jié)果，檢測(cè)成功結(jié)果滿意，符合率可達(dá)100%，滿足病理診斷的需求。

部分肺癌晚期患者由于獲取標(biāo)本比較困難，穿刺標(biāo)本比較微小，蠟塊上的組織已所剩無(wú)幾，難以再行切片。或者部分會(huì)診患者帶來(lái)的白片數(shù)量有限，前期常規(guī)及免疫組化檢測(cè)已經(jīng)用完，而返回原就診醫(yī)院重新制片既不方便，又延誤患者的及時(shí)診治，并增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

本研究旨在探索一種標(biāo)本回收利用的新方法，通過(guò)有效利用僅存的切片進(jìn)行后續(xù)輔助檢查。將病理切片圖像信息通過(guò)全玻片數(shù)字掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)全數(shù)字化，形成數(shù)字切片，保存了現(xiàn)有的病理圖像的同時(shí)，重利用免疫組化染色過(guò)的切片進(jìn)行分子檢測(cè)，滿足診斷需求，為患者提供預(yù)后信息和精準(zhǔn)的藥物治療指導(dǎo)，促進(jìn)向精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。近年來(lái)，癌癥的發(fā)病率明顯增多，嚴(yán)重威脅人類健康，腫瘤的研究也成為全球的熱點(diǎn)。盡管腫瘤的研究方法和研究角度在不斷更新，但人體腫瘤組織標(biāo)本是腫瘤研究不可或缺的重要對(duì)象。如不及時(shí)保存，將會(huì)丟失重要的臨床科研資源。應(yīng)用這種標(biāo)本回收再利用的新方法，在保存了現(xiàn)有的病理圖像的同時(shí)，重新利用組織切片進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，為病理醫(yī)師和臨床醫(yī)師開(kāi)展臨床科研工作提供了基礎(chǔ)。

FFPE技術(shù)已經(jīng)被認(rèn)為是保存組織形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)［8］。雖然，人們普遍認(rèn)為組織固定、處理、包埋、染色等步驟會(huì)破壞生物分子的完整性；但多項(xiàng)研究表明FFPE標(biāo)本中仍具有有價(jià)值的信息［9-10］。隨著靶向治療藥物的不斷涌現(xiàn)，為腫瘤患者的治愈或緩解帶來(lái)更多的希望，腫瘤靶點(diǎn)的個(gè)體化分子檢測(cè)越來(lái)越受到臨床的重視，腫瘤標(biāo)本的珍貴性顯而易見(jiàn)［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC FFPE標(biāo)本經(jīng)免疫組化染色后能夠提取高質(zhì)量的DNA，并且可以用于靶基因的下游分子分析，是值得推廣的技術(shù)方法。