G蛋白耦聯(lián)受體C家族6組A亞型在前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用

孫心旖，盛 彬，陳 瑤，李 莉，楊建一，杜圣家，劉 銘

0 引 言

前列腺癌（prostate cancer，PCa）在西方發(fā)達(dá)國家男性新發(fā)病例中位居第一，死亡率位居第三，隨著我國生活方式及環(huán)境改變，PCa的發(fā)病率和死亡率也在逐步上升，成為威脅男性健康的一大問題［1?4］。大部分PCa患者在中晚期雄激素剝奪治療后容易發(fā)展成為去勢耐藥PCa，是臨床治療上的難點(diǎn)，我們需要為PCa的治療尋找新的靶點(diǎn)［5?7］。

G蛋白耦聯(lián)受體C家族6組A亞型（G protein cou?pledreceptorfamilyCgroup6memberA，GPRC6A）作為G蛋白耦聯(lián)受體C家族的成員，是在2010年由全基因組關(guān)聯(lián)研究鑒定并確證的PCa易感基因［7］。它在人體內(nèi)腎、骨骼肌、睪丸、前列腺、白細(xì)胞等多種組織細(xì)胞均有表達(dá)［3］。GPRC6A融合了能與骨鈣素和睪酮結(jié)合的7次跨膜結(jié)構(gòu)域以及識別L?α氨基酸和陽離子的捕蠅草結(jié)構(gòu)域，因此它能與多種配體結(jié)合［9?10］。經(jīng)驗(yàn)證GPRC6A在內(nèi)分泌和代謝方面發(fā)揮著重要作用，它的缺失會導(dǎo)致代謝綜合征、糖穩(wěn)態(tài)失衡等。有研究表明GPRC6A可能參與PCa的骨轉(zhuǎn)移［11?12］。

ERK作為絲裂原活化蛋白激酶成員，可整合G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號。ERK通路中總細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶在生長因子作用下活化成為磷酸化激活的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Phospho extracellular signal?regulated kinase，P?ERK），使 ERK 通路被激活，而ERK通路是多種因子參與調(diào)控細(xì)胞生長的重要途徑［13?14］。它被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和存活，抑制ERK信號通路對腫瘤有治療作用［15?16］。

在前期實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了過表達(dá)GPRC6A的慢病毒載體pCDH?GPRC6A，通過人胚腎293T細(xì)胞包被病毒后感染LncapC4?2細(xì)胞株，Puromycin篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)GPRC6A的LncapC4?2 GPRC6A細(xì)胞，并且以慢病毒空載體pCDH建立對照組LncapC4?2 PCDH細(xì)胞［17］。本研究的主要目的是研究GPRC6A在激素不敏感的PCa細(xì)胞系LncapC4?2細(xì)胞增殖、凋亡中的作用。此外，通過MEK/ERK抑制劑U0126阻斷ERK通路，觀察GPRC6A介導(dǎo)的ERK在PCa細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料Lncap C4?2細(xì)胞購自北京博奧派克生物科技有限公司。GPRC6A過表達(dá)的LncapC4?2 GPRC6A和對照組LncapC4?2 PCDH細(xì)胞株由前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建［17］。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和多孔培養(yǎng)板（美國corn?ing公司）。U0126（美國MCE公司）、CCK8增殖試劑盒（武漢博士德生物公司）、APC Annexin V Apopto?sis Detection Kit with 7?AAD流式試劑盒（美國Bio?Legend公司）、細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司）。鼠抗BCL2、兔抗Cleaved?caspase3和兔抗CyclinD1（武漢博士德生物公司）、兔抗GPRC6A（英國Abcam公司）、兔抗ERK1/2和兔抗p?ERK1/2（美國Cell Signaling Technology公司）、兔抗GAPDH（美國proteintech公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物有限公司）。流式細(xì)胞儀（美國BD FACSCali?bur）、酶標(biāo)儀（美國THERMO Multiskan GO）。

1.2方法

1.2.1 CCK8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為LncapC4?2 PCDH 組、LncapC4?2 GPRC6A 組和 LncapC4?2 GPRC6A+U0126組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，PBS洗滌后，胰酶消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整成2.5×104個/mL，96孔板中每孔加入200 μL，即每孔5000個細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后饑餓24 h，LncapC4?2 GPRC6A+U0126組中分別加入3、5、7、10 μmol/L的U0126混合液。藥物作用24h后，在測定前1h，按照培養(yǎng)基與CCK8試劑10∶1配成混合液，測定孔每孔加入100 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，檢測A值，連續(xù)測定藥物作用24、48、72h的A值。通過生長曲線計(jì)算出最適藥物作用濃度，并檢測3組的細(xì)胞增殖變化。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期LncapC4?2 PCDH 組、LncapC4?2 GPRC6A 組 、LncapC4?2 GPRC6A+U0126組，在6孔板中各設(shè)3個復(fù)孔，24 h細(xì)胞貼壁后，換為不含血清培養(yǎng)基饑餓24 h后，將U0126與培養(yǎng)基混合配成10 μmol/L的U0126混合液，在LncapC4?2 GPRC6A+U0126組中每孔加入2 mL，培養(yǎng)24h后用不含EDTA的胰酶消化，離心半徑10 cm，1000 r/min離心5 min，棄去上清，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇中，吹打制成單細(xì)胞懸液，放入4℃過夜固定。第2天，1000 r/min離心5 min，PBS洗滌，1000 r/min 離心 5 min，棄去 PBS 后加入 100 μL RNase和150 μL PI染色液，充分吹打混勻，在避光處靜置30min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡LncapC4?2 PCDH 組 、LncapC4?2 GPRC6A 組 、LncapC4?2 GPRC6A+U0126組，各設(shè)3個復(fù)孔，待6孔板中細(xì)胞貼壁后，饑餓24 h，然后將U0126配成10 μmol/L的混合液，LncapC4?2 GPRC6A+U0126組每孔加入2 mL，培養(yǎng)24 h后用不含EDTA胰酶消化2 min，離心半徑10 cm，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌細(xì)胞，1000 r/min離心 5 min，加入 500 μL 的Binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V?APC混勻后，加入5μL 7?AAD染液混勻，避光30 min后上機(jī)檢測。

1.2.4 Western blot檢測凋亡、周期相關(guān)蛋白的表達(dá)3組細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，饑餓處理24 h后，在加U0126組中加入含10 μmol/L U0126的完全培養(yǎng)液處理24h。加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min后，4℃離心收集上清液，以BCA試劑盒檢測蛋白濃度。15%SDS?PAGE分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%BSA封閉液室溫封閉1 h。1∶1000的抗GPRC6A，1∶2000的抗ERK，1∶2000的抗P?ERK，1∶400的抗Caspase3、1∶400的抗 Bcl2、1∶400的抗CyclinD1和1∶6000的抗GAPDH，4℃條件下過夜。TBST洗膜5次，5min/次。分別加入相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床1h，TBST洗膜5次，5min次，曝光條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用one?way ANOVA 檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GPRC6A過表達(dá)對PCa細(xì)胞增殖的影響Western blot法結(jié)果表明，與LncapC4?2 PCDH組比較，LncapC4?2 GPRC6A組的GPRC6A和P?ERK表達(dá)增加（P＜0.05）；與LncapC4?2 GPRC6A組比較，Ln?capC4?2 GPRC6A+U0126組的P?ERK的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖 1。CCK8 檢測表明 LncapC4?2 GPRC6A組相較LncapC4?2 PCDH組增殖加快（P＜0.05），而 LncapC4?2 GPRC6A+U0126 組相較 Ln?capC4?2 GPRC6A 組 增 殖 明 顯 減 慢（P＜0.05），見圖2。

圖1 LncapC4?2 GPRC6A細(xì)胞及U0126處理后GPRC6A和p?ERK的表達(dá)Figure 1 The GPRC6A and p?ERK protein expression of LncapC4?2 GPRC6A overexpression cells and after U0126 treated

圖2 CCK8檢測GPRC6A對細(xì)胞增殖的影響Figure 2 CCK8 detected the effect of GPRC6A on cell proliferation

2.2 GPRC6A過表達(dá)對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Western blot結(jié)果顯示 LncapC4?2 GPRC6A 組的CyclinD1 蛋 白 表 達(dá)（0.88±0.04）較 LncapC4?2 PCDH 組（0.66±0.02）明 顯 升 高（P＜0.05），而LncapC4?2 GPRC6A+U0126組 CyclinD1的蛋白表 達(dá)（0.71±0.02）較 LncapC4?2 GPRC6A 組 明 顯降低（P＜0.05），見圖 3。流式細(xì)胞儀 檢 測結(jié)果 顯 示 LncapC4?2 GPRC6A 組 的 G1/（S+G2）值較 LncapC4?2 PCDH 組 明 顯降 低（P＜0.05）；Ln?capC4?2 GPRC6A+U0126 組 的 G1/（S+G2）值 較LncapC4?2 GPRC6A 組 明 顯 升 高（P＜0.05），見圖4。

圖3 GPRC6A過表達(dá)細(xì)胞和U0126處理后CyclinD1的表達(dá)Figure 3 CyclinD1 expression of LncapC4?2 GPRC6A overexpression cells and after U0126 treated

2.3 GPRC6A過表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果表明，LncapC4?2 GPRC6A組的 凋 亡 比 例（3.64%）較 LncapC4?2 PCDH 組（9.00%）和 LncapC4 ?2GPRC6A+U0126 組（19.57%）明顯降低（P＜0.05），見圖5。同時 West?ern blot檢測結(jié)果表明，LncapC4?2 GPRC6A 組Bcl2的表達(dá)比 LncapC4?2 PCDH 組高，活化 Cas?pase3 的 表 達(dá) 則 降 低（P＜0.05）；LncapC4?2 GPRC6A+U0126組相對于 LncapC4?2 GPRC6A 組Bcl2的表達(dá)降低，活化Caspase3的表達(dá)則增高（P＜0.05），見圖 6。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測GPRC6A對細(xì)胞增殖的影響Figure 4 low cytometry detected the effect of GPRC6A on cell proliferation

圖5 流式細(xì)胞儀檢測GPRC6A對細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Flow cytometry detected the effect of GPRC6A on apoptosis

圖6 GPRC6A對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl2和Cleaved?cas?pase3的影響Figure 6 The effect of GPRC6A on Bcl2 and Cleaved?cas?pase3 protein expression

3 討 論

GPRC6A與PCa的發(fā)生發(fā)展之間的機(jī)制目前尚未清楚，但是經(jīng)研究GPRC6A對PCa有潛在的直接和間接影響［18］。GPRC6A在PCa細(xì)胞株和腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與PCa的風(fēng)險和進(jìn)展有關(guān)，GPRC6A在PCa發(fā)展過程中ERK起到了一定的作用。

MAPK超家族包括3個亞家族：ERK1/2，JNK/SAPK和p38 MAPK，其中的ERK 1/2在增殖、生長、分裂和分化過程中起著重要作用［19?21］。ERK 1/2磷酸化后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP?responseelementbindingprotein，CREB），CREB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因［22?23］。ERK通路在腫瘤發(fā)展過程中的作用已被各種實(shí)驗(yàn)研究所支持，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有促腫瘤作用［24?25］。ERK的磷酸化水平在PCa中增高，它作為PCa風(fēng)險的關(guān)鍵因素，但其潛在的遺傳基礎(chǔ)尚不清楚［26］。本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建的過表達(dá)GPRC6A的PCa LncapC4?2細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探究是否通過ERK通路影響細(xì)胞增殖與凋亡。在GPRC6A高表達(dá)后，可以看出ERK的磷酸化水平相比對照組也明顯增高。在使用了抑制劑抑制了ERK磷酸化后，細(xì)胞的周期被明顯阻滯在G1期，細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制，凋亡則增高。ERK的激活在PCa細(xì)胞增殖中起著核心作用。GPRC6A作為ERK信號的一種強(qiáng)有力的激活因子［18］，在ERK受到抑制后，對LncapC4?2的調(diào)控作用明顯減弱，細(xì)胞生長減慢。

CDK 4或CDK 6的活性是細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換所必需的，CyclinD1能與CDK 4或CDK 6的調(diào)節(jié)亞基形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期G1?S進(jìn)程［27］。GPRC6A過表達(dá)的PCa細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變明顯增加。在流式的細(xì)胞周期圖像中也可以看出GPRC6A表達(dá)上調(diào)后S期細(xì)胞比例明顯增加。說明GPRC6A促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而促進(jìn)了PCa細(xì)胞的增殖，CCK8的結(jié)果也同樣反應(yīng)了GPRC6A對于細(xì)胞增殖的正性調(diào)控作用。

BCL2是PCa的發(fā)生發(fā)展中的抗凋亡基因，在腫瘤發(fā)展過程中抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放后激活Caspase蛋白酶［28］。Caspase3作為Caspase家族主要成員，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Cas?pase3的激活與PCa細(xì)胞的凋亡有著密切關(guān)系［29］。GPRC6A過表達(dá)LncapC4?2細(xì)胞BCL2的表達(dá)明顯高于對照組，而Caspase3的表達(dá)正好相反，說明PCa細(xì)胞的凋亡過程受到了抑制，流式檢測凋亡的結(jié)果也同樣證實(shí)了這一結(jié)論。但是GPRC6A如何引起與PCa細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)因子的改變，具體機(jī)制需要今后深入研究。

綜上所述，GPRC6A在PCa細(xì)胞LncapC4?2中扮演著促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡的角色，并且可能是通過ERK通路參與此過程。