LC-MS／MS法同時測定復(fù)方丹參顆粒和復(fù)方丹參滴丸中6種成分

洪 艷， 文曉霞， 李 莎， 于 凱， 夏玉鳳?

（1.金鴻藥業(yè)股份有限公司研究所，廣東珠海 519041；2.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 211198）

復(fù)方丹參方由丹參、三七、冰片配伍組成，1977年由上海中藥二廠研制成功并投入生產(chǎn)，方中丹參為君藥，所含丹參酮ⅡA、隱丹參酮等脂溶性成分具有擴張冠狀動脈、提高冠脈血流、保護心肌、廣譜抑菌作用，而丹參素、原兒茶醛、丹酚酸等水溶性成分具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、保護心臟微血管內(nèi)皮細胞等作用[1-4］；三七為臣藥，主要有效成分為皂苷，具有抗血栓形成、擴張血管、保護心肌等作用[5-7］；冰片為佐使藥，引藥入經(jīng)，三藥配伍，相輔相成，起到協(xié)同增效作用。

復(fù)方丹參方主要用于治療冠心病心絞痛，在臨床上因其療效確切，不良反應(yīng)少，而被開發(fā)成多種劑型，如2015版 《中國藥典》就收載有復(fù)方丹參丸、片、膠囊、噴霧劑 （氣霧劑）、顆粒、滴丸6種劑型[8］，其藥物組成、功能主治均相同，但處方中各藥用量、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標準等有所差異，其中復(fù)方丹參滴丸因服用方便、起效迅速而成為治療冠心病心絞痛的急救藥品，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制值得探討。目前，有關(guān)復(fù)方丹參片與滴丸的質(zhì)量分析、藥理作用等方面的報道較多[9-11］，而復(fù)方丹參顆粒是通過新型輔料及新工藝制成的顆粒劑，具有溶散時間短、釋放速度快、防濕性能強、質(zhì)量穩(wěn)定、服用方便等特點，具有較好的市場應(yīng)用前景，但相關(guān)研究較少。因此，本實驗建立LCMS／MS法同時測定復(fù)方丹參顆粒和復(fù)方丹參滴丸中丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA的含有量，以期為進一步比較兩者作用特點提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 LC System、Agilent 6420 Triple Quad LC／MS （美國 Agilent公司）；SB-5200DT超聲波清洗機 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；Sartorius BT25S電子天平；Direct-Q超純水系統(tǒng) （美國Millipore公司）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 （湖南湘儀儀器有限公司）。

1.2 試藥 丹參素鈉 （批號110855-201614）、三七皂苷 R1（批號 110745-201619）、人參皂苷 Re（批號 110754-201626）、人參皂苷 Rg1（批號110703-201731）、人參皂苷 Rb1（批號 110704-201625）、丹參酮ⅡA（批號110766-201721）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。復(fù)方丹參顆粒（金鴻藥業(yè)股份有限公司，批號170509、170506、170422）；復(fù)方丹參滴丸 （天津天士力制藥股份有限公司，批號170421、161115、160531）。乙腈為色譜純 （德國默克公司）；甲醇為色譜純 （江蘇漢邦科技有限公司）；甲酸為色譜純 （上?？死敔栐噭黄渌噭┚鶠榉治黾?；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Eclipse Plus C18色譜柱 （3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相乙腈 （A） -0.1%甲酸（B）， 梯度洗脫 （0～1 min， 10%A； 1～2 min，10%～20%A；2～10 min，20% ～40%A；10～15 min， 40%A； 15～16 min， 40% ～98%A； 16～26 min，98%A，再運行 6 min）；體積流量0.3 mL／min； 進樣量 5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源 （ESI），正、負離子快速切換多重反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM）檢測，0～21 min為負離子模式，21～26 min為正離子模式；干燥氣體N2，溫度350℃，體積流量9 L／min；霧化器壓力35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；毛細管電壓5 000 V（正離子模式）、4 000 V （負離子模式）。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 對照品溶液制備 精密稱取丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA對照品適量，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得貯備液。分別精密量取適量于2 mL量瓶中，甲醇-0.1%甲酸 （50∶50）稀釋至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度分別為3 335.40、 2 888.00、 2 922.00、 1 834.56、 2 793.00、183.08 ng／mL）。

2.4 供試品溶液制備 取顆粒、滴丸適量，研缽中充分碾磨均勻，分別精密稱取約10 mg，置于具塞棕色瓶中，加入25 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，兩者續(xù)濾液加入甲醇-0.1%甲酸（50∶50） 分別稀釋 10、 2倍， 12 000 r／min離心10 min，取上清液，即得。

2.5 專屬性考察 吸取甲醇空白對照、對照品、供試品溶液適量，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分峰形良好，陰性無干擾。

圖1 各成分LC-MS／MS色譜圖Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.3”項下對照品溶液適量，甲醇-0.1%甲酸 （50∶50）稀釋成系列質(zhì)量濃度，在 “2.1”和 “2.2”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y）進行回歸，再分別以信噪比 S／N＝10、S／N＝3時的質(zhì)量濃度作為定量限和檢測限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗 將同一對照品溶液在 “2.1”和 “2.2”項條件下進樣測定6次，測得丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1、丹參酮ⅡA峰面積 RSD分別為0.41%、1.88%、2.42%、1.32%、1.76%、1.95%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 （顆粒批號170509，滴丸批號170421），于室溫下放置0、1、2、3、4、6 h后在 “2.1” 和 “2.2” 項條件下進樣測定，測得顆粒和滴丸中丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA峰面積 RSD分別為1.52%、4.91%、4.77%、 2.56%、 4.52%、 1.50% 和 2.02%、4.34%、4.78%、3.39%、4.11%、2.05%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批顆粒 （批號170509）和滴丸 （批號170421），按 “2.4”項下方法制備供試品溶液6份，在 “2.1”和 “2.2”項條件下進樣測定，測得顆粒和滴丸中丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA含有量 RSD分別為2.33%、4.83%、5.00%、 2.40%、 4.71%、 2.53% 和 1.45%、3.81%、4.83%、1.89%、5.01%、4.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的顆粒 （批號 170509）和滴丸 （批號 170421） 各5 mg，精密加入500 μL對照品溶液，平行6份，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”和 “2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，顆粒中丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮ⅡA平均加樣回收率分別為 96.64%、100.67%、98.79%、105.74%、99.18%、99.53%，RSD分別為 2.19%、 4.41%、 4.23%、 1.86%、 1.94%、4.88%；滴丸中各成分平均加樣回收率分別為95.76%、98.95%、103.10%、102.25%、101.66%、104.59%，RSD分別為 2.18%、4.76%、3.72%、1.96%、4.45%、1.99%。

2.11 樣品含有量測定 取不同批號顆粒、滴丸各3批，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”和 “2.2”項條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果 （mg／g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇 本實驗考察了不同體積分數(shù)甲醇 （25%、50%、75%、100%）對6種成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)25%、50%甲醇提取時，丹參酮ⅡA提取率較低；甲醇提取時，丹參素鈉提取率減少，并與75%甲醇提取時存在顯著差異；75%甲醇提取時，各成分提取率均較高，故選擇其作為提取溶劑。

3.2 色譜條件優(yōu)化 本實驗比較了不同型號、粒徑的色譜柱，發(fā)現(xiàn)Eclipse Plus C18色譜柱 （3.0 mm×150 mm，3.5 μm）分離效果較好。再考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸 （含 10 mmol／L醋酸銨）、乙腈-0.1%甲酸等體系，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%甲酸條件下各成分響應(yīng)更好，故選擇其作為流動相。

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 由于各成分性質(zhì)差異較大，故本實驗通過離子檢測模式對其進行考察，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1在負離子模式下響應(yīng)較好，而丹參酮ⅡA在正離子模式下響應(yīng)較好。為了使上述成分均有最高的靈敏度，本實驗采用正負離子切換模式，從而確保它們均能在各自最佳電離模式下進行檢測。

3.4 含有量分析 表3顯示，除丹參素鈉在復(fù)方丹參顆粒中含有量較低外，其他5種成分含有量均高于復(fù)方丹參滴丸。復(fù)方丹參顆粒和復(fù)方丹參滴丸是同一方劑衍生出的不同劑型，其功能主治相同，均為活血化瘀、理氣止痛，但兩者有效成分含有量差異較大，這將影響臨床療效。中藥復(fù)方發(fā)揮療效具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，是一個復(fù)雜的體內(nèi)過程，故藥物作用強度除了與制劑中主要有效成分含有量密切相關(guān)外，有效成分作用方式、生物利用度、不同劑型對其體內(nèi)吸收的影響等因素也將影響療效。目前，針對復(fù)方丹參滴丸體內(nèi)吸收特點有一些探索性研究[12-14］，但鮮有復(fù)方丹參顆粒中有效成分藥代動力學、作用機制及與劑型間關(guān)系的報道，本實驗可為后期對該制劑進一步研究提供有價值的信息。