探討惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理檢測(cè)

蔡四忠

（遼寧省撫順市第四醫(yī)院，遼寧 撫順 113123）

按照病理類型分類，惡性淋巴瘤可分為B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、NK細(xì)胞淋巴瘤，臨床研究指出，惡性淋巴瘤起源于淋巴造血系統(tǒng)，關(guān)于其病因目前尚不明確，臨床提倡早發(fā)現(xiàn)早治療[1]。隨著對(duì)惡性淋巴細(xì)胞的不斷研究，逐步形成了多元化的診斷和治療策略，尤其是在診斷方面可通過免疫組化方法、病理形態(tài)學(xué)方法、分子遺傳學(xué)以及臨床癥狀癥狀表現(xiàn)等進(jìn)行綜合分析。遺傳學(xué)技術(shù)的開展與應(yīng)用使得惡性淋巴瘤分子病理檢測(cè)輔助診斷成為一種可能。為明確惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排分子病理特點(diǎn)以及在臨床病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值，筆者結(jié)合我院在2016年1月至2018年6月研究的180例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應(yīng)性增生患者，探討Ig/TCR基因重排的分子病理檢測(cè)對(duì)其診斷價(jià)值，相關(guān)內(nèi)容分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：研究時(shí)間在2016年1月至2018年6月，研究對(duì)象為180例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應(yīng)性增生患者，共有210例，其中男性患者139例，女性患者71例，年齡24～64歲、平均年齡（42.25±4.67）歲，所有患者同意進(jìn)行研究，各項(xiàng)資料完整。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：研究中的試劑主要有：①購買自TakaRa公司的10×PCRbutter、rTaqDNA聚合酶；②天根生化科技有限公司生產(chǎn)的50bp marker、6×loading butter、2.5 mmol/Ld、NRP mixture；③QIAGEN公司提供的QIAamp?DNA FFPEtissie Kit；④上海生工生物工程有限公司合成的對(duì)照參考基因、引物等。

1.2.2 方法：整個(gè)操作過程包括以下步驟：①提取DNA。將獲取的組織切成厚度為4 μm石蠟切片，共需要5～10片，脫蠟處理，根據(jù)QIAGEN公司提供的QIAamp?DNA FFPEtissie Kit操作說明完成實(shí)際檢測(cè)，對(duì)濃度以及純度的檢測(cè)采用紫外分光光度計(jì)；②引物設(shè)計(jì)：對(duì)Ig基因克隆性重排的47條引物使用3730毛細(xì)血管電泳檢測(cè)，通過引物組合進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括輕鏈，包括IgLκ、IGLλ，重鏈為IgH，重鏈分為A、B、C、D、E五組，檢測(cè)VH-JH。IgLκ和對(duì)Vκ-Jλ、Vκ-κde檢測(cè)，涉及到IgLκ-A、IgLκ-B，Vλ-Jλ使用IgLλ檢測(cè)。TCR基因克隆充分分析引物56條，通過引物組合完成TCPβ、TCRγ以及TCRδ檢測(cè)，將TCPβ分為三組，分別是A組、B組、C組，對(duì)Vβ-Jβ以及Dβ-Jβ的檢測(cè)。將TCRγ檢測(cè)分為A組與B組，內(nèi)對(duì)照引物S共有4條，擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的片段長度包括101bp、200bp、300bp以及395bp；③PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增體系為25 μL，引物為0.1 μmol/L，2UrTap DNA聚合酶，設(shè)置如下反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度94 ℃，時(shí)間10 min。94 ℃，45 s，60 ℃，45 s，72 ℃，90 s，反復(fù)進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)共有40次，在72 ℃條件下延伸10 min，并在4 ℃條件下保存；④毛細(xì)管電泳、基因掃描：使用ABI 3730XL遺傳分析儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物四十毛細(xì)管電泳處理，使用配套軟件對(duì)基因數(shù)據(jù)實(shí)施處理，對(duì)樣本進(jìn)行DNA質(zhì)量分析期間需要對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增條帶為101bp、200bp、300bp以及395bp，對(duì)不同DNA的完整性以及質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。標(biāo)本如果不能檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的目的條帶，說明DNA樣本不滿足質(zhì)量要求。

1.3 觀察指標(biāo)：觀察指標(biāo)主要是B細(xì)胞淋巴瘤Ig基因重排結(jié)果以及T細(xì)胞性淋巴瘤TCR基因重排分析結(jié)果。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：不同樣品在擴(kuò)增處理后，如果對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物處于檢測(cè)有限范圍內(nèi)，同時(shí)能夠獲取擴(kuò)增產(chǎn)物不連續(xù)信號(hào)單峰評(píng)價(jià)為陽性。沒有熒光信號(hào)的或者曲線表現(xiàn)為高斯分布則評(píng)定為陰性[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)分析使用Excel，不同數(shù)據(jù)表示為百分率。

2 結(jié) 果

2.1 B細(xì)胞淋巴瘤Ig基因重排：表1所示為B細(xì)胞淋巴瘤Ig基因重排結(jié)果，15例淋巴反應(yīng)性增生沒有Ig基因單克隆重排條帶的擴(kuò)增。

2.2 T細(xì)胞淋巴瘤TCP基因重排結(jié)果：表2所示為TCR基因重排與T細(xì)胞淋巴瘤組織類型關(guān)系分析結(jié)果，15例淋巴反應(yīng)性增生沒有TCR基因單克隆重排條帶的擴(kuò)增。

3 討 論

惡性腫瘤的研究是戰(zhàn)勝疾病，改善患者生活質(zhì)量以及生存質(zhì)量的重要途徑。淋巴惡性腫瘤作為常見的惡性腫瘤。國內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)資料顯示，惡性淋巴瘤在我國惡性腫瘤中位居11～13位。與此同時(shí)，惡性淋巴腫瘤的新發(fā)病例呈現(xiàn)出逐年上升趨勢(shì)，整個(gè)惡性腫瘤中有4.00%～5.00%為惡性淋巴腫瘤[3]。通過對(duì)惡性淋巴細(xì)胞瘤的研究對(duì)改善惡性淋巴瘤的治療以及預(yù)后具有重要意義。

臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，惡性淋巴瘤中絕大多數(shù)為非霍奇金淋巴瘤（NHL），包含了B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、NK細(xì)胞淋巴瘤，其中B細(xì)胞淋巴瘤占到90.00%～95.00%。T細(xì)胞淋巴瘤占到5.00%～7.00%，NK細(xì)胞淋巴瘤不足2.00%。有序的V-D-J基因通過重排組合以及拼接后可形成不淋巴細(xì)胞編碼，其基因?yàn)镮g肽鏈。T淋巴細(xì)胞基因編碼則分布于α肽鏈、g肽鏈、β肽鏈以及δ肽鏈?；蛑嘏排c組合過程期間依靠V-D-J、V-J-C基因?qū)崿F(xiàn)重排。不同腫瘤細(xì)胞都是來源于同一個(gè)克隆的單克隆性重排，較為典型的如Ig基因、TCR基因等。最新研究指出，正常的淋巴組織以及反應(yīng)性淋巴組織在組織細(xì)胞起源方面不具有一致性，本身為多克隆性重排，TCR基因或者是Ig基因。本文研究是建立在國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上，也就是免疫球蛋白（Ig）和T細(xì)胞受體（TCR）基因存在重排現(xiàn)象且較為特殊，在淋巴細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化之前存在基因重排問題，良性病變中對(duì)應(yīng)的T細(xì)胞或者B細(xì)胞基因重排形式較為特殊，通過電泳可發(fā)現(xiàn)不同長度DNA存在抹帶，上述研究為本文研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

表1 Ig基因重排與B細(xì)胞淋巴瘤組織類型關(guān)系分析

表2 TCR基因重排與T細(xì)胞淋巴瘤組織類型關(guān)系分析

關(guān)于相關(guān)淋巴細(xì)胞瘤基因研究的文獻(xiàn)逐漸增加，有學(xué)者[4]對(duì)113例B細(xì)胞性淋巴瘤患者進(jìn)行基因檢測(cè)，研究中發(fā)現(xiàn)IgH克隆性重排對(duì)應(yīng)陽性率高達(dá)82.30%；有學(xué)者[5]對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行檢查，共有患者46例。通過對(duì)IgH克隆性重排的檢測(cè)，其中Igl對(duì)應(yīng)的陽性檢出率為36.96%，Igκ對(duì)應(yīng)的陽性檢出率為82.61%，整個(gè)IgH克隆性重排陽性率達(dá)到91.30%?；谏鲜鱿嚓P(guān)研究分析，本研究中對(duì)130例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應(yīng)性增生患者進(jìn)行基因重排檢測(cè)，IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE、IgLA、IgLB、IgLA、IgH（A+B+C+D+E）+IgL（A+B）+IgLA陽性率分別為47.69%、33.07%、35.38%、19.23%、6.92%、45.38%、22.30%、30.00%、96.15%。與上述研究相比，研究中樣本數(shù)量明顯增加，最終IgH克隆性重排對(duì)應(yīng)陽性率較上述研究提高，這可能與較為成熟的操作技術(shù)有關(guān)。關(guān)于T細(xì)胞性淋巴瘤TCR基因重排的相關(guān)研究也較多。有文獻(xiàn)中報(bào)道了T細(xì)胞性淋巴瘤的研究，共有患者45例，研究后顯示總體陽性率達(dá)到91.11%。有文獻(xiàn)中分析了T細(xì)胞性淋巴瘤中TCRG、TCRB、TCRD等不同基因陽性率，樣本共有50例，對(duì)應(yīng)的陽性率達(dá)到94.00%、84.00%以及36.00%，總體聯(lián)合檢查陽性率達(dá)到96.00%[6]。結(jié)合上述研究，本文對(duì)50例T細(xì)胞性淋巴瘤患者基因重排結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)和分析，涉及到TCR基因重排有TCRB-A、TCRB-B、TCRB-C、TCRG-A、TCRG-B、TCRTCRD、TCRβ+TCR+TCRδ，對(duì)應(yīng)的陽性率分別為32.00%、56.00%、22.00%、60.00%、22.00%、34.00%、78.00%?？傮w陽性率達(dá)到78.00%，較上述文獻(xiàn)陽性率降低，可能與患者個(gè)體差異性有關(guān)。

結(jié)合國內(nèi)報(bào)道，由然等學(xué)者在研究認(rèn)為外周血淋巴細(xì)胞免疫表型分析可為皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的臨床診斷提供佐證，對(duì)其診斷和鑒別具有重要價(jià)值。綜合本文研究結(jié)果，后期應(yīng)加大惡性淋巴瘤診多項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合診斷研究，便于提高良性與惡性腫瘤病變準(zhǔn)確率[7]。

綜上所述，惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理特點(diǎn)可作為B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤診斷的重要參考。