苦參素對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血液流變學(xué)的影響及機(jī)制探討*

瞿娟娟，王雙宇，張 超，徐海發(fā)，陳惠敏，周少英，韓亞非，王朝宗，余 婷

（1．邯鄲市中心醫(yī)院東區(qū)急診科，邯鄲 056000；2．邯鄲市中心醫(yī)院腎內(nèi)一科，邯鄲 056001；3．邯鄲市中醫(yī)院內(nèi)科，邯鄲 056001）

隨著人口老齡化的加劇，缺血性腦血管病已逐漸發(fā)展成為致殘和死亡的主要疾病之一，盡快通過(guò)藥物溶栓或介入治療以恢復(fù)血流再灌注是挽救患者生命、降低血栓后遺癥的首要治療方案，但缺血再灌注并發(fā)癥的存在卻嚴(yán)重影響著其治療效果。缺血再灌注損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中血液流變性指標(biāo)改變是其重要的病理機(jī)制之一[1-2]?？鄥⑺兀∣MT）為傳統(tǒng)中藥品種苦參的主要有效成分之一，既往研究發(fā)現(xiàn)OMT能夠通過(guò)抑制繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等而對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用[3-4]，但關(guān)于OMT能否改善腦缺血再灌注后血液流變學(xué)改變的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)，本研究將通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)研究OMT對(duì)腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠（雌雄不限）購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 OMT購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)：20170114）；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：161209）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司（批號(hào)：161209）；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20170309、20170413、20170114）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與模型制備 取140只實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和OMT低[25 mg/（kg·d）]、中[50 mg/（kg·d）]、高[100 mg/（kg·d）]劑量組，每組28只。通過(guò)線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，假手術(shù)組行手術(shù)操作但不插入栓線。術(shù)后第2天開(kāi)始腹腔注射給藥治療（1 次/d），療程 7 d[8]。

1.3.2 神經(jīng)功能評(píng)分 采用10分制盲法評(píng)分：置地上，向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分；提鼠尾，缺血對(duì)側(cè)前肢腕屈曲計(jì)1分、肘屈曲計(jì)2分、肩內(nèi)旋計(jì)3分；對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降，據(jù)下降程度計(jì)1～3分；置金屬網(wǎng)上，據(jù)缺血對(duì)側(cè)肌張力下降程度計(jì)1～3分。

1.3.3 腦組織含水量和梗死體積 每組隨機(jī)選取6只大鼠，深度麻醉后斷頭并剝?nèi)∧X組織，去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織質(zhì)量（W），110℃恒溫烘烤48 h后稱質(zhì)量（D），腦組織含水量計(jì)算公式：腦含水量（%）=[（W-D）/W]×100%。每組另隨機(jī)取6只大鼠，深度麻醉后斷頭取腦，置于-20℃冷凍15 min后沿冠狀切片（厚度約2 mm），于2%的TTC染色液中避光孵育0．5 h（梗死區(qū)呈蒼白色），運(yùn)用圖像分析軟件計(jì)算大腦組織梗死百分比。

1.3.4 腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 各組隨機(jī)取6只大鼠，參照1．3．3方法取大腦、多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d、石蠟包埋、切片、脫蠟水化，然后行常規(guī)HE染色，封片后通過(guò)顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.5 抗氧化酶活性和MDA含量 各組取剩余10只大鼠，參照1．3．3方法取大鼠大腦并剝?nèi)『ｑR組織，研磨勻漿、3 000 rpm離心10 min取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定抗氧化酶（SOD、CAT）活性和MDA含量。

1.3.6 血液流變學(xué)指標(biāo)及紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo)于1．3．5斷頭取腦前，開(kāi)腹并經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，做抗凝處理，用R-80錐板型血液流變檢測(cè)儀測(cè)定全血黏度（低切、中切、高切）和血漿黏度，計(jì)算紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變性指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞壓積，測(cè)定血沉；測(cè)定紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo)：熒光偏振度、平均微黏度、各向異性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用軟件SPSS 19．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和梗死體積均顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和梗死體積顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積（±s）Tab.1 Neurological function score，brain tissue water contents and brain tissue infarct volume of rats in each group(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積（±s）Tab.1 Neurological function score，brain tissue water contents and brain tissue infarct volume of rats in each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù)神經(jīng)功能評(píng)分 腦含水量（%）腦梗死體積（%）假手術(shù)組 6 0．00±0．00 78．01±1．39 0．00±0．00模型組 6 8．35±0．87** 85．89±1．70** 28．03±2．79**OMT 低劑量組 6 8．20±1．18 84．32±2．19 24．94±3．40 OMT 中劑量組 6 6．32±0．76## 80．58±1．78# 21．62±2．59#OMT 高劑量組 6 4．79±0．50## 78．41±1．84## 18．13±2．10##

2.2 苦參素對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層次清晰，排列整齊，形態(tài)完整，核膜、核仁清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)層次紊亂，排列稀疏、間隙增大、數(shù)量減少，胞體腫脹變形，胞核固縮或溶解等形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變；與模型組比較，OMT各劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度改善，該效果以O(shè)MT高劑量組最為顯著。見(jiàn)圖1。

2.3 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織抗氧化酶（SOD、CAT）活性顯著降低且 MDA 含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠海馬組織SOD、CAT活性顯著提高且MDA含量顯著降低（P＜0．05或P＜0．01）。見(jiàn)表 2。

2.4 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

圖1 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×400）Fig.1 Morphological structure of neurons in hippocampal CA1 region of rats in each group(HE，×400)

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（x±s）Tab.2 The activities of SOD，CAT and MDA in hippocampus of rats in each group±s)

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（x±s）Tab.2 The activities of SOD，CAT and MDA in hippocampus of rats in each group±s)

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

?

2.4.1 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠全血黏度、血漿黏度的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠全血黏度低、中、高切均顯著升高（P＜0．05），血漿黏度顯著升高（P＜0．01）。與模型組比較，OMT 中、高劑量組大鼠全血黏度低、中、高切及血漿黏度均顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度（x±s）Tab.3 Blood viscosity and plasma viscosity of rats in each group(±s)mPa·s

表3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度（x±s）Tab.3 Blood viscosity and plasma viscosity of rats in each group(±s)mPa·s

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù) 全血黏度 血漿黏度低切 中切 高切假手術(shù)組 10 10．18±0．65 5．82±0．41 4．12±0．38 1．19±0．12模型組 10 12．76±1．50*6．87±0．56*5．17±0．60*1．68±0．18**OMT 低劑量組 10 12．00±1．59 6．50±0．65 4．80±0．49 1．58±0．20 OMT 中劑量組 10 11．03±1．52#5．97±0．62#4．62±0．44#1．37±0．13#OMT 高劑量組 10 10．82±1．20#5．51±0．46#4．25±0．38#1．28±0．09##

2.4.2 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)均顯著升高（P＜0．05），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低（P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)并顯著升高紅細(xì)胞變形指數(shù)均顯著降低（P＜0．05或P＜0．01）。見(jiàn)表 4。

2.4.3 OMT對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉顯著升高（P＜0．05 或 P＜0．01）；與模型組比較，OMT中、高劑量組大鼠紅細(xì)胞壓積和血沉均顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見(jiàn)表 5。

3 討論

缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響缺血性腦病患者治療效果，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，既往病理研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦病患者血液血液黏度增高，呈濃、黏、凝、聚狀態(tài)[5-6]，血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著高于正常對(duì)照組，表現(xiàn)出紅細(xì)胞變形能力下降、聚集程度升高以及血液黏度提高等指標(biāo)變化[7]，血液高凝狀態(tài)將導(dǎo)致局部血液微循環(huán)持續(xù)惡化，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性凋亡[2，8]，為缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一。因此，通過(guò)改善血液流變學(xué)以預(yù)防梗死灶進(jìn)一步擴(kuò)大和二次腦?；蛟S是提高急性缺血性腦病患者臨床療效有效方案。

表4 各組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)（±s）Tab.4 Red blood cell aggregation index，rigidity index and deformation index of rats in each group(±s)

表4 各組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)（±s）Tab.4 Red blood cell aggregation index，rigidity index and deformation index of rats in each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

紅細(xì)胞變形指數(shù)假手術(shù)組 10 2．31±0．17 4．87±0．54 1．03±0．09模型組 10 3．15±0．40* 6．21±0．94* 0．58±0．06**OMT 低劑量組 10 2．64±0．31 5．59±0．84 0．70±0．08 OMT 中劑量組 10 2．48±0．20# 5．01±0．70# 0．78±0．05#OMT 高劑量組 10 2．33±0．25# 4．68±0．53# 0．90±0．08##組別 動(dòng)物數(shù) 紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞剛性指數(shù)

表5 各組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉（±s）Tab.5 Hematocrit and ESR of rats in each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù) 紅細(xì)胞壓積（%） 血沉（mm/h）假手術(shù)組 10 2．19±0．16 0．76±0．05模型組 10 3．23±0．32* 1．02±0．08**OMT 低劑量組 10 2．88±0．31 0．93±0．11 OMT 中劑量組 10 2．59±0．25# 0．85±0．07#OMT 高劑量組 10 2．37±0．20# 0．77±0．04##

苦參（Sophora flavescens Ait．）味苦、性寒，具有清熱燥濕、利水退黃、祛風(fēng)殺蟲(chóng)之功效。OMT是苦參的主要有效成分之一，具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性[8-9]以及擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等藥理學(xué)作用[11]，但OMT是否能夠改善腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)而起到一定保護(hù)作用的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型并腹腔注射給予苦參素進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)OMT 50～100 mg/（kg·d）治療能夠有效降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、改善神經(jīng)功能癥狀，降低腦組織含水量，降低腦組織梗死體積，抑制腦組織海馬CA1區(qū)病變，改善海馬CA1區(qū)抗氧化酶活性（SOD、CAT）并降低MDA含量[12-13]、降低氧化應(yīng)激損傷，提示OMT對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OMT干預(yù)治療能夠顯著降低腦缺血再灌注大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度以及血漿黏度，降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)并提高紅細(xì)胞變性指數(shù)，減低紅細(xì)胞壓積和血沉，提示OMT具有改善腦缺血再灌注損傷大鼠血液流變學(xué)、改善血液高凝狀態(tài)、改善局部微循環(huán)的作用。

總之，OMT可能通過(guò)改善血液流變學(xué)而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用。