溫陽補腎方對兔激素性股骨頭壞死組織中骨保護素和核因子-κB受體活化因子及其配體mRNA表達的影響

宋紅梅，魏迎辰，李楠，王和鳴,

1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建福州市350003；2.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽合肥市230061；3.福建中醫(yī)藥大學，福建福州市350122

激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)指大劑量激素引起的股骨頭中活性成分死亡的病理過程，如脂肪細胞、骨髓造血細胞和骨髓細胞等[1]。有研究認為，激素已成為導致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主因[2]。溫陽補腎方作為福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)協(xié)定方，大量臨床應用結果證實其治療SANFH療效確切。本研究觀察溫陽補腎方對兔SANFH組織中骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B,RANK)和核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)的mRNA表達的影響，探討其防治SANFH的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

46只普通級新西蘭兔，雌雄各半，體質(zhì)量1.7～2.5 kg，上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供，許可證號SCXK(滬)2012～0011。研究過程中對動物的處理均按照國家頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》和福建中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會的要求嚴格執(zhí)行。

1.2 實驗藥品、試劑及儀器

1.2.1 溫陽補腎方制備

組成：骨碎補9 g、巴戟天15 g、鹿角膠6 g、淫羊藿9 g、三七3 g、丹參9 g、黃芪15 g、牛膝9 g、郁金9 g、甘草3 g。由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院制備，生藥濃度2.5 g/ml。

1.2.2 實驗試劑

甲潑尼龍琥珀酸鈉，500 mg/瓶，批號Z06177，附稀釋液1瓶：美國輝瑞制藥有限公司。特級馬血清，200 ml/瓶，批號20121121：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2.3 實驗儀器

BM-Ⅶ生物組織包埋機：孝感宏業(yè)醫(yī)療儀器公司。UC6超薄切片機：德國LEⅠCA公司。生物蛋白質(zhì)垂直電泳儀：北京百晶。凝膠成像系統(tǒng)：上海培清科技有限公司。微量紫外分光光度計：美國NANODROP公司。9600型PCR儀：美國PE生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組

46只新西蘭兔(普通級)適應性喂養(yǎng)2周，分為正常組(n=10)和造模組(n=36)。造模后隨機選取正常組2只、造模組4只處死，用于模型鑒定。再將造模組剩余32只采用隨機數(shù)字法分為模型組，中藥低、中、高劑量組，每組8只。整個實驗按照國際動物保護條例進行[3-4]。

1.3.2 造模及鑒定

應用改進馬血清聯(lián)合甲基強的松龍法造模[5]。完成后，運用光學顯微鏡，通過觀察股骨頭的病理改變、骨小梁及骨陷窩的變化進行模型鑒定。

1.3.3 藥物干預

正常組和模型組只用10 ml/d生理鹽水灌胃。中藥3個劑量組按照以下標準灌胃：依照Meeh-Rubner公式[6]計算，A(體表面積，m2)=K(系數(shù))×W(體質(zhì)量，g)×2/3×10-4聯(lián)合人兔用藥劑量換算公式最后算得，中藥低、中、高劑量組分別為6.44 g/(kg·d)、9.66 g/(kg·d)、12.88 g/(kg·d)[7]。每天灌胃，連續(xù)8周后取材。

1.4 評價方法

1.4.1 組織病理學觀察

造模后，隨機選取正常組2只，造模組4只處死，取材、脫鈣、切片、常規(guī)HE染色。

正常組2只雙側股骨頭(n=4)，造模組4只雙側股骨頭(n=8)。光鏡下統(tǒng)計兩組骨陷窩和空骨陷窩的數(shù)目，于10×40倍的高倍鏡下從各觀測切片中選3個不重復區(qū)域，每個區(qū)域內(nèi)選取骨陷窩50個，從中獲得空骨陷窩的數(shù)目，由此計算空骨陷窩率(空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)/50×100%)。3個區(qū)域共得出3個空骨陷窩率，取平均值[8]。

1.4.2 逆轉錄聚合酶鏈反應檢測OPG、RANK和RANKL的mRNA表達

溫陽補腎方連續(xù)灌胃8周后，空氣栓塞法處死兔子。首先進行RNA提取，將-80℃冰箱內(nèi)的組織標本量共l00 mg在液氮內(nèi)搗碎研磨，常溫裂解，離心提取，用DEPC水、氯仿、異丙醇、乙醇處理離心純化；再應用微量紫外分光光度計進行RNA濃度與純度的測定，采用凝膠成像軟件觀測所選RNA跑出的的電泳帶圖像，進行RNA完整性的測定；用DNase處理提取的RNA，以TOYOBO的反轉錄反應試劑盒繼續(xù)完成cDNA合成操作，在PCR反應儀內(nèi)做反轉錄。然后進行熒光定量PCR，應用Primer 5.0軟件對引物序列加以設計；最后PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，mRNA表達水平均以目標因子與β-actin比值表示。引物均由上海生工公司供給。序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學分析

選用SPSS 17.0軟件對結果進行統(tǒng)計處理。計量資料以(±s)表示，模型鑒定用獨立樣本t檢驗；組間比較應用單因素方差分析，方差齊用LSD方法，方差不齊用Games-Howell方法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 組織病理學觀察

2.1.1 HE染色

正常組骨小梁致密規(guī)則，結構正常，股骨頭軟骨厚度適中，表面光滑；骨細胞形態(tài)一律正常，核居于骨陷窩中央；股骨頭各層細胞均勻分布，可見大量規(guī)則排列的軟骨細胞，偶爾可見散在的空骨陷窩；髓腔內(nèi)分布著大量的骨髓細胞，少量正常的脂肪細胞。見圖1。

模型組股骨頭軟骨變薄，軟骨表面出現(xiàn)剝脫裂紋；骨小梁稀疏，不規(guī)則，甚至斷裂；各種細胞呈散在不規(guī)則排列。與正常組比較，骨細胞減少，形成大量空骨陷窩；軟骨細胞少見，出現(xiàn)廣泛簇積現(xiàn)象；骨髓細胞數(shù)減少，髓腔內(nèi)隨處可見肥大、變性、壞死甚至形成囊泡融合的脂肪細胞。見圖2。

表1 引物序列

圖1 正常組HE染色

圖2 模型組HE染色

2.1.2 空骨陷窩率

模型組空骨陷窩率顯著高于正常組(P＜0.001)。見表2。

表2 正常組與模型組空骨陷窩率比較(%)

2.2 OPG、RANK和RANKL的mRNA表達

2.2.1 OPGmRNA表達

與正常組比較，模型組OPG mRNA表達明顯降低(P＜0.01)；與模型組比較，中藥各劑量組OPG mRNA表達均明顯升高(P＜0.01)；中藥中、高劑量組較中藥低劑量組OPG mRNA表達明顯升高(P＜0.01)；中藥中、高劑量組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖3。

2.2.2 RANK mRNA表達

與正常組比較，模型組RANK mRNA表達明顯升高(P＜0.01)；與模型組比較，中藥各劑量組RANK mRNA表達均明顯降低(P＜0.01)；中藥中、高劑量組較中藥低劑量組RANK mRNA表達明顯降低(P＜0.01)；中藥中、高劑量組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖3。

2.2.3 RANKL mRNA表達

與正常組比較，模型組RANKL mRNA表達明顯升高(P＜0.01)；與模型組比較，中藥各劑量組RANKL mRNA表達均明顯降低(P＜0.01)；中藥中、高劑量組較中藥低劑量組RANKL mRNA表達明顯降低(P＜0.05)；中藥中、高劑量組比較無顯著性差異(P ＞ 0.05)。見表3、圖3。

圖3 各組OPG、RANK和RANKL的mRNA表達

3 討論

SANFH病因病機尚未完全明確，存在多種學說[9-14]。有學者認為，一方面激素直接作用于成骨細胞、骨細胞和破骨細胞，減緩成骨細胞的分化和增殖速度，使成骨細胞迅速凋亡，提高破骨細胞的存活時間，導致骨量流失，伴隨股骨頭塌陷；另一方面，激素還可加速血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而促使血栓的形成，通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達，抑制血管修復和血管新生，導致血管舒縮活性物質(zhì)表達障礙，影響脂質(zhì)代謝。

因此，促進新骨的形成已經(jīng)成為治療SANFH核心要素。OPG、RANK和RANKL作為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的家族成員，可以調(diào)節(jié)破骨細胞和骨吸收過程，而且在骨吸收和骨重建過程中起著非常重要的作用[15-16]。RANK作為RANKL的受體，分布于破骨細胞前體細胞膜。作為Ⅱ型跨膜蛋白，RANKL可直接與RANK結合，通過促使破骨細胞前體向成熟破骨細胞轉化，直接激活成熟破骨細胞，最終誘導骨吸收。因此在破骨細胞發(fā)育和活化的過程中，RANKL成為非常關鍵的因素[17]。OPG和RANKL的競爭性結合可阻斷骨吸收的信號轉導通路，也阻礙破骨細胞的發(fā)育和成熟。

傳統(tǒng)醫(yī)學稱本病為“骨蝕”“骨痿”“骨痹”等?！靶爸鶞?，其氣必虛”，機體受到病邪入侵，臟腑器官的功能隨之受損，導致人體抵抗力下降。因此，許多學者將本病的內(nèi)因歸為先天稟賦不足，素體氣虛，氣不衛(wèi)外，外邪侵襲而發(fā)為本病；認為外邪內(nèi)襲或跌撲損傷等為本病致病的外因，均能導致經(jīng)脈損傷，氣血失司，瘀阻于脈絡，致使股骨頭缺血，日久發(fā)為本病。本病的致病外邪多為寒邪、濕邪、熱邪等。寒邪為陰邪，“陰勝則陽病”，故寒勝即損傷陽氣，致血液凝滯，瘀阻在局部從而導致骨壞死。另外，內(nèi)服伐損藥物而損傷正氣、勞損、創(chuàng)傷、內(nèi)傷七情、外感六淫和飲食不節(jié)等所導致的內(nèi)傷，均會造成局部的氣血失司而發(fā)生股骨頭壞死。傳統(tǒng)醫(yī)學干預SANFH，多從整體觀念入手，認為其本在于骨，其源在于血，其根在于腎[18]。

王和鳴制定出活血祛瘀、溫陽補腎的治療大法，認為“補虛重在補腎，補腎重在溫腎壯陽”[19]，陽氣充盛，溫煦和推動之力增強，氣行則血行。前期研究表明[7,20-27]，溫陽補腎中藥可促進成骨細胞增殖，刺激成骨細胞分泌堿性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)與骨鈣素(bone glaprotein,BGP)，刺激成骨細胞表達轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，并形成大量的Ⅰ型膠原，以利于骨生成。SANFH血清OPG下降，RANKL上升，OPG/RANKL值下降。溫陽補腎方可以提高血清OPG、BGP、N-末端Ⅰ型前膠原肽(procollagen ⅠN-terminal propeptide,PⅠNP)表達，降低RANK和RANKL表達，抑制破骨細胞的活化，促進新骨的形成。

本研究選用成年新西蘭大白兔，按照改進馬血清聯(lián)合甲基強的松龍的造模法進行造模，結果發(fā)現(xiàn)，模型組股骨頭軟骨變薄，軟骨表面出現(xiàn)剝脫裂紋；骨小梁稀疏，不規(guī)則，甚至斷裂；各種細胞呈散在不規(guī)則排列。骨細胞減少，形成大量空骨陷窩；軟骨細胞出現(xiàn)廣泛簇積現(xiàn)象；骨髓細胞數(shù)減少，髓腔內(nèi)隨處可見肥大、變性、壞死甚至形成囊泡融合的脂肪細胞。模型組空骨陷窩率增加，OPG mRNA表達降低，RANK和RANKL的mRNA表達均升高。中藥各劑量組OPG mRNA表達升高，RANK和RANKL的mRNA表達均降低，中、高劑量組比低劑量組更明顯，中、高劑量組之間無顯著性差異。這表明溫陽補腎方能提高SANFH股骨頭組織中OPG mRNA表達，抑制RANK和RANKL的mRNA表達。

綜上所述，溫陽補腎方可以調(diào)節(jié)OPG、RANK和RANKL的mRNA表達，從而加速誘導成骨細胞及破骨細胞活性，可能為溫陽補腎方有效防治SANFH的機制之一。本研究結果顯示，中劑量為溫陽補腎方使用的最佳劑量選擇，還有待臨床進一步證實。本研究為僅以股骨頭組織為實驗對象的體內(nèi)實驗，還需要體外實驗進一步闡明溫陽補腎方對SANFH的療效機制。