蘋(píng)果炭疽病菌拮抗酵母菌的篩選與鑒定

陳汝，冉昆，王傳增，薛曉敏，王金政

（山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000）

蘋(píng)果是山東省種植規(guī)模最大的優(yōu)勢(shì)果品，其中紅富士是主栽品種之一，種植面積約占70%?？茖W(xué)防治病蟲(chóng)害關(guān)系著蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)可持續(xù)發(fā)展[1]。蘋(píng)果膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides） 是蘋(píng)果的主要侵染性病害之一，可引起蘋(píng)果生長(zhǎng)期和貯藏期的產(chǎn)量與品質(zhì)損失[2～4]。使用化學(xué)殺菌劑易帶來(lái)病原菌抗藥性增加、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問(wèn)題[5]。而生物防治具有安全、環(huán)保等特點(diǎn)，因此備受關(guān)注。酵母菌具有抗逆性強(qiáng)、耐貧瘠、繁殖速度快、不產(chǎn)生毒素等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治植物病害中具有廣闊的應(yīng)用前景[6～8]，因此篩選高度抑制蘋(píng)果炭疽病菌的拮抗菌對(duì)生物防治該病害尤為重要。自然界中，海水、土壤以及植物的葉片、根系、果實(shí)表面等廣泛附著具有代表性的酵母菌群[9]，蘋(píng)果園中亦含有大量的酵母菌種資源[10，11]。研究表明，能有效抑制蘋(píng)果果實(shí)病害的生防酵母菌有Rhodotorula glutinis、Metschnikowia pulcherrima、Pichia caribbica 等[12～14]。拮抗酵母菌的作用機(jī)制主要包括營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)寄主抗病性以及直接的寄生作用等[6，7]。果實(shí)表面的酵母菌與病原菌在同一生境位置，并且有效定殖、適應(yīng)能力強(qiáng)，是篩選高效生防酵母菌的首選[15～17]。從紅富士果實(shí)表面分離、純化酵母菌，篩選其中對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌抑制效果較好的拮抗酵母，并對(duì)其進(jìn)行分子學(xué)鑒定，旨為蘋(píng)果炭疽病害生物防治的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘋(píng)果炭疽病菌由山東省果樹(shù)研究所提供，病原菌株編號(hào)為Acg1，采用組織分離法從具有炭疽病癥狀的紅富士果實(shí)樣品中分離、純化、鑒定并保藏[18]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化 采集成熟健康的紅富士蘋(píng)果，采用稀釋分離法[11]從蘋(píng)果果實(shí)表面分離、純化酵母菌株19 株。稱(chēng)取果皮1 g，加入液體富集培養(yǎng)基（酵母浸粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、氯霉素200 μg/mL） 10 mL 置于50 mL 三角瓶中搖勻，25 ℃下150 轉(zhuǎn)/min 培養(yǎng)2 d 后稀釋涂布YPD 平板（氯霉素200 μg/mL）。25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)不同的菌落，平板劃線純化后轉(zhuǎn)接斜面。根據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、邊緣和其他表面特征等進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步歸類(lèi)[19]。4 ℃下短期保存或者置于20%甘油管中-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 拮抗酵母菌的篩選 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。首先，將蘋(píng)果炭疽病菌株Acg1 置于28 ℃的PDA 平板上活化培養(yǎng)72 h，用打孔器制成直徑為5 mm 的菌片；然后，將菌片移植轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板中央，菌絲面朝下；最后，用接種環(huán)挑取少量活化好的酵母菌株，沿病原菌菌片四周對(duì)稱(chēng)等距離劃直線，以平板中央只接種病原菌菌片而不接種待測(cè)酵母菌株的平板為對(duì)照。28 ℃下培養(yǎng)4 d，觀察并記錄病原菌的菌落直徑（十字交叉法）。每個(gè)酵母菌種處理重復(fù)3 次，計(jì)算抑菌率〔CK 菌落直徑-處理菌落直徑） /CK 菌落直徑×100%〕。

1.2.3 酵母菌的鑒定 按照Makimura 等[20]的方法進(jìn)行DNA 提取。按照Kurtzman 等[21]的方法進(jìn)行核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列擴(kuò)增，所用引物為NL1 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′和NL4 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′。PCR 采用25 μL體系：10×PCR buffer（2.5 mmol/L，含Mg2+） 2.5 μL，NL1（10 μmol/L） 0.5 μL，NL4（10 μmol/L） 0.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL，DNA 模板0.75 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.25 μL，最后添加滅菌水18.5 μL。使用BIO-RAD S1000TM PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。電泳檢測(cè)、回收純化后的PCR 產(chǎn)物，交由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將所測(cè)菌株的26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列提交GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），進(jìn)行BLAST 分析，與相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。選取與菌株親緣關(guān)系較近的菌株，應(yīng)用Clustal X軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)[22]，利用MEGA5.1 軟件中鄰接法（Neighbor-joining，N-J） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 重復(fù)1 000 次[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌的篩選

在與蘋(píng)果炭疽病菌的對(duì)峙試驗(yàn)中，PDA 平板上接種酵母菌株YG3 后雖無(wú)明顯的抑菌圈，但蘋(píng)果炭疽病菌菌絲稀疏，生長(zhǎng)明顯弱于對(duì)照（圖1）。計(jì)算得出抑菌率為55.6%。

圖1 酵母菌與蘋(píng)果炭疽病菌的平板對(duì)峙Fig.1 Plate confrontation between yeast and C. gloeosporioides of apple

2.2 拮抗酵母菌序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以酵母菌株YG3 純培養(yǎng)物總DNA 為模板，獲得大小為640 bp 的核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列。將酵母菌株YG3 基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)（GenBank NO.MF045447）。Blast 搜索結(jié)果顯示，該片段與Cryptococcus spp.的同源性高達(dá)99%以上。采用Clustal X 軟件與親緣關(guān)系較近的酵母菌基因序列進(jìn)行多重比對(duì)，應(yīng)用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2） 顯示，酵母菌株YG3 與Cryptococcus flavescens（GenBank NO.AB035042）、Cryptococcus flavescens（GenBank NO.FJ743610）、Cryptococcus flavescens（GenBank NO.AM160631）、 Cryptococcus flavescens（GenBank NO.KF830175） 和Cryptococcus flavescens（GenBank NO.KM246005） 聚在同一分支上。據(jù)此，將酵母菌株YG3 鑒定為Cryptococcusflavescens。

圖2 基于26S rDNA D1/D2 區(qū)序列Neighbor-Joining 構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis of 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment

3 結(jié)論

拮抗 酵 母 菌 在 蘋(píng) 果[7，12～14]、橘[24]、桃[25，26]、葡 萄[27]、草莓[28，29]等果樹(shù)病害的生物防治中均有所應(yīng)用，且取得了不同程度的抑菌效果。如，拮抗菌Metschnikowia pulcherrima 對(duì)芒果采后炭疽病菌有明顯的拮抗作用[15，30]；Cryptococcus laurentii 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)（特別是對(duì)蔗糖的競(jìng)爭(zhēng)）、空間競(jìng)爭(zhēng)以及誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等有效抑制芒果炭疽病害[31]；Pichia membranaefaciens酵母單獨(dú)或與殼聚糖聯(lián)合能有效控制柑橘類(lèi)水果炭疽病的發(fā)生[32]。本研究中，通過(guò)蘋(píng)果炭疽病菌平板對(duì)峙試驗(yàn)，對(duì)從蘋(píng)果果實(shí)表面分離、純化得到的19 株酵母菌進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)酵母菌株YG3 可明顯抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)，病原菌菌絲稀疏、生長(zhǎng)弱，抑菌率為55.6%。經(jīng)過(guò)核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列的比較，將酵母菌株YG3 鑒定為Cryptococcus flavescens（Gen－Bank NO.MF045447）。對(duì)于Cryptococcus flavescens 對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的抑菌機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。