2 株植物內(nèi)生菌對油菜和小麥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

楊亞茹，茆少星，閆淑珍，陸長梅

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210024）

植物內(nèi)生菌是指生活在植物組織和器官內(nèi)部的微生物，其不會(huì)使宿主植物表現(xiàn)出外在病癥，但可通過組織學(xué)方法或從表面嚴(yán)格消毒的植物組織中分離出來。與宿主植物共生過程中，內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)生激素、促進(jìn)營養(yǎng)元素釋放和吸收等方式調(diào)節(jié)植物生長，直接抑制病蟲害以提高宿主植物的抗性；可通過ISR 效應(yīng)等提高宿主植物對生物與非生物脅迫的抗性等[1～4]。大多數(shù)內(nèi)生菌對宿主具有專一性，因此其使用范圍相對較窄；再加上不同菌劑的作用機(jī)制和作用效果相差很大、微生物菌劑功能單一等因素，均制約了微生物菌劑的發(fā)展[1，4]。

蠟狀芽孢桿菌SZ5（Bacillus cereus） 和熒光假單胞菌DLJ1（Pseudomonas fluorescens biovar I） 是在篩選產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-a minocyclopropane-1-carboxylate，ACC） 脫氨酶微生物時(shí)，分別從柿子和辣椒的成熟果實(shí)中分離獲得的2 株植物內(nèi)生菌。它們均能在非宿主植物番茄中定殖，并促進(jìn)番茄生長和抗性提高[5]；能提高辣椒植株對南方根結(jié)線蟲的抗性，其中，SZ5 還具有降低大麗輪枝菌（Verticillium da hliae） 毒素毒性的作用[6]。

由于DLJ1 和SZ5 對某些病蟲害具有一定的抑制作用，且宿主具有一定的多樣性，因此探究二者能否促進(jìn)其他植物（如大宗農(nóng)作物） 的生長，對于擴(kuò)展其應(yīng)用范圍具有一定的價(jià)值。鑒于此，以小麥（單子葉植物） 和油菜（雙子葉植物） 為試材，探究DLJ1 和SZ5 菌劑對小麥和油菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，并初步探討其作用機(jī)理和適宜處理時(shí)機(jī)，旨為拓展DLJ1 和SZ5 菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜和小麥種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。供試植物內(nèi)生菌蠟狀芽孢桿菌SZ5（自成熟柿子分離） 和熒光假單胞菌（生物型I） DLJ1（自辣椒果實(shí)分離），均由南京師范大學(xué)微生物工程研究中心篩選獲得，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)皿冷藏保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌劑及種子的前處理

1.2.1.1 制備菌劑。參照劉維紅等[5]的方法，將2 個(gè)菌株在NA 培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h 獲得純培養(yǎng)物；取純培養(yǎng)物在4 ℃下8 000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，收集沉淀和上清液（發(fā)酵液），備用。將沉淀菌體用無菌水洗滌2 次后，再用無菌水重懸沉淀至OD600為0.5±0.02，制得濃度相當(dāng)于108cfu/mL 的菌懸液，備用。

1.2.1.2 種子處理。將供試種子先后于70%酒精中消毒1 min、1%的NaClO 溶液中消毒10 min，然后用無菌水充分洗滌5 次，于25～28 ℃黑暗條件下浸種12 h，備用。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn) 采用培養(yǎng)皿濾紙法[7]進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，整個(gè)操作在無菌條件下進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)培養(yǎng)液處理，分別為無菌水（CK）、NA 培養(yǎng)液、SZ5菌懸液、SZ5 發(fā)酵液、DLJ1 菌懸液和DLJ1 發(fā)酵液。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入1 張濾紙，加入培養(yǎng)液5 mL 浸潤，于濾紙上放置飽滿的備用種子30 粒，每處理3 次重復(fù)。油菜于28℃（晝）/25℃（夜）、14h（光照）/10h（黑暗）條件下培養(yǎng)；小麥于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)。每隔12 h觀察1 次。每天采用稱重法補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分，并記錄萌發(fā)種子數(shù)。在萌發(fā)終止（4 d） 時(shí)，計(jì)算各處理的發(fā)芽率（發(fā)芽種子數(shù)∕供試種子數(shù)×100%）、發(fā)芽勢（發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，本文中發(fā)芽高峰為第2 天） 和萌發(fā)指數(shù)〔∑（Gt/Dt），式中，Gt 為在時(shí)間t 的種子萌發(fā)數(shù)，Dt 為相應(yīng)的萌發(fā)時(shí)間〕。測定萌發(fā)苗的發(fā)育情況[8]。

1.2.3 幼苗生長試驗(yàn) 將備用種子置于無菌水培養(yǎng)皿中，黑暗培養(yǎng)至萌發(fā)后，備用。采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行幼苗生長試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)培養(yǎng)液處理，分別為無菌水（CK）、NA 培養(yǎng)液、SZ5 菌懸液、SZ5 發(fā)酵液、DLJ1 菌懸液和DLJ1 發(fā)酵液。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入1 張濾紙，加入培養(yǎng)液5 mL 浸潤，于濾紙上放置萌發(fā)狀態(tài)一致的萌發(fā)苗30 株，每處理3 次重復(fù)。在28 ℃（晝）/25 ℃（夜） 培養(yǎng)箱中，先黑暗培養(yǎng)4 d，然后再14 h（光照） /10 h（黑暗） 培養(yǎng)2 d 后，對幼苗生長狀況進(jìn)行測定。

將幼苗經(jīng)掃描儀掃描后，利用根系分析儀Epson Perfection V700 Photo（J221A，日本） 和葉面積分析儀Epson Perfection V500 Photo（日本），分析計(jì)算各處理幼苗的根系長度、根系表面積、胚軸長度、葉長和不定根數(shù)。

1.2.4 激素相關(guān)物質(zhì)檢測 生長素吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA） 定性檢測參照Glickmann 等[9]的方法，采用Salkowski 比色液，在室溫下避光反應(yīng)，比較反應(yīng)液是否變成粉紅色。赤霉素（gibberellin，GA）活性測定參照薛泉宏等[10]的熒光法。ACC 脫氨酶活性檢測則是將DLJ1 和SZ5 純培養(yǎng)菌體重懸于ADF 培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后，參照Honma 等[11]和Saleh 等[12]的方法，以每毫克可溶性蛋白每小時(shí)產(chǎn)生的α-丁酮酸的量代表ACC 脫氨酶活性大小?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量測定采用Bradford 法[13]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行測定。

1.2.5 Fe 載體的定性檢測 將2 個(gè)菌株接種于金葡菌甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，MSA） 培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 轉(zhuǎn)/min 條件下培養(yǎng)48 h 后，觀察培養(yǎng)液的顏色，并離心菌液獲得上清液；在紫外-可見光光度計(jì)下連續(xù)掃描上清液，觀察在405 nm 波長處是否存在吸收峰。培養(yǎng)液呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光、405 nm 處存在吸收峰，代表菌株可以產(chǎn)生Fe 載體[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel、Photoshop 和SPSS 18.0 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的整理與分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)期菌劑處理對油菜和小麥種子萌發(fā)以及萌發(fā)苗生長的影響

2.1.1 對種子萌發(fā)的影響

2.1.1.1 油菜種子。與無菌水對照處理相比，萌發(fā)期NA 培養(yǎng)液處理對油菜種子的最終發(fā)芽率以及萌發(fā)速度（發(fā)芽勢） 和質(zhì)量（發(fā)芽指數(shù)） 均有顯著的抑制作用，且抑制作用均為最大；SZ5 和DLJ1 菌懸液處理對油菜種子的最終發(fā)芽率、萌發(fā)速度和質(zhì)量有一定的抑制作用，但均未達(dá)到顯著水平；SZ5 發(fā)酵液處理對油菜種子的最終發(fā)芽率、萌發(fā)速度和質(zhì)量均有顯著的抑制作用，DLJ1 發(fā)酵液處理僅對油菜種子的萌發(fā)速度有顯著的抑制作用（表1）?？傮w來看，SZ5 處理對種子萌發(fā)的抑制程度高于DLJ1 處理。

2.1.1.2 小麥種子。與無菌水對照處理相比，雖然各處理均對種子發(fā)芽率無顯著影響，但2 個(gè)菌劑的發(fā)酵液處理均導(dǎo)致小麥發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)降低，且除DLJ1 發(fā)酵液處理的小麥發(fā)芽指數(shù)外，其他指標(biāo)與CK 差異均達(dá)到了顯著水平；NA 培養(yǎng)液處理的抑制作用弱于發(fā)酵液處理，與CK 相比，指標(biāo)差異均不顯著；2 種菌劑菌懸液處理對小麥種子萌發(fā)速度和質(zhì)量的作用不同，其中SZ5 菌懸液處理表現(xiàn)為促進(jìn)作用、DLJ1 菌懸液處理表現(xiàn)為抑制作用，但均未達(dá)到顯著水平。

表1 萌發(fā)期SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 at germination stage on seed germination of rape and wheat

可以看出，萌發(fā)期分別用2 個(gè)菌劑的不同培養(yǎng)液處理油菜和小麥種子，雖然對最終發(fā)芽率影響較小，但2 個(gè)菌劑的發(fā)酵液處理均顯著延緩了種子萌發(fā)。NA培養(yǎng)液處理對油菜種子萌發(fā)抑制作用明顯，說明NA培養(yǎng)液或發(fā)酵液中可能存在抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。

2.1.2 對萌發(fā)苗生長的影響 伴隨著種子生長，不同培養(yǎng)液處理對油菜和小麥種子萌發(fā)苗生長的影響程度不同（表2）。NA 培養(yǎng)液處理顯著降低了油菜萌發(fā)苗的主根長度，明顯提高了其子葉面積；而對小麥苗的生長無顯著影響。2 個(gè)菌劑菌懸液處理中，除SZ5 菌懸液處理顯著降低油菜萌發(fā)苗的主根長度外，其他處理對油菜苗的生長均無顯著影響；但可顯著促進(jìn)小麥胚根生長，其中DLJ1 菌懸液的促生效應(yīng)更為顯著。SZ5 發(fā)酵液處理雖然可顯著促進(jìn)油菜萌發(fā)苗子葉擴(kuò)大，但顯著抑制了其主根的生長；而對小麥萌發(fā)苗的生長存在不明顯的抑制作用；DLJ1 發(fā)酵液處理則對油菜萌發(fā)苗的下胚軸、根系和子葉生長以及小麥胚根生長均有顯著的促進(jìn)作用。

表2 萌發(fā)期SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥萌發(fā)苗生長的影響Table 2 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 at germination stage on the growth of rape and wheat seedlings

綜合來看，雖然萌發(fā)期2 個(gè)菌劑的發(fā)酵液處理延緩了油菜和小麥種子萌發(fā)，但DLJ1 發(fā)酵液可顯著促進(jìn)油菜萌發(fā)苗生長，DLJ1 發(fā)酵液、菌懸液以及SZ5菌懸液可顯著促進(jìn)小麥萌發(fā)苗生長，且DLJ1 處理萌發(fā)苗的長勢優(yōu)于SZ5 處理。

2.2 萌發(fā)后菌劑處理對油菜和小麥幼苗生長的影響

與無菌水對照相比，NA 培養(yǎng)液處理僅對油菜根伸長有明顯的抑制作用；SZ5 發(fā)酵液和DLJ1 發(fā)酵液處理雖然也對油菜根系伸長有一定抑制作用，但抑制幅度小于NA 培養(yǎng)液；2 個(gè)菌劑的菌懸液處理均對油菜幼苗生長無顯著影響（表3）。

在小麥的各處理中，只有DLJ1 菌懸液可顯著促進(jìn)小麥幼苗根系伸長，SZ5 發(fā)酵液可顯著降低小麥幼苗根系表面積，其他處理均對小麥幼苗生長無顯著影響。

表3 萌發(fā)后SZ5 和DLJ1 菌劑處理對油菜和小麥幼苗生長的影響Table 3 Effects of inoculation of SZ5 and DLJ1 after germination on the growth of rape and wheat seedlings

綜合來看，在油菜和小麥種子萌發(fā)后再進(jìn)行菌劑處理，短時(shí)間（6 d） 內(nèi)對幼苗生長的促進(jìn)效應(yīng)較弱。

2.3 菌劑的作用機(jī)制

微生物菌劑對植物的作用機(jī)制集中在產(chǎn)植物激素及與植物激素相關(guān)的物質(zhì)、為植物生長提供必需的營養(yǎng)元素、抑制病原微生物生長、提高植物免疫能力等方面[1～4]。本研究結(jié)果顯示，萌發(fā)期SZ5 和DLJ1 菌劑的發(fā)酵液處理均對油菜和小麥種子萌發(fā)具有明顯的延緩作用；但在種子萌發(fā)后，DLJ1 發(fā)酵液處理對萌發(fā)苗生長有明顯的促進(jìn)作用，且2 個(gè)菌株發(fā)酵液的作用效果均大于其菌懸液。由此推測，可能是發(fā)酵液中存在某種物質(zhì)對種子萌發(fā)和生長產(chǎn)生了影響。

2.3.1 菌劑發(fā)酵液中植物激素等相關(guān)物質(zhì) 在SZ5 和DLJ1 的發(fā)酵液中均未檢測出IAA 或GA 等促進(jìn)種子萌發(fā)的激素，但檢測到了降解乙烯合成前體ACC 的ACC 脫氨酶（表4）。DLJ1 發(fā)酵液中ACC 脫氨酶活性高達(dá)54.657 6 μmol/（mg·h），是SZ5 的4 倍。在已報(bào)道的可分泌ACC 脫氨酶的微生物中，DLJ1 分泌的ACC脫氨酶活性相對較高[5，6，15～18]。

伴隨著植物種子萌發(fā)，會(huì)出現(xiàn)乙烯釋放高峰[18，19]。ACC 為乙烯合成前體，ACC 脫氨酶可以通過降解乙烯合成前體ACC，從而減少種子萌發(fā)過程中乙烯的產(chǎn)生[17～20]。雖然DLJ1 發(fā)酵液中ACC 脫氨酶活性高于SZ5 發(fā)酵液，但其對油菜和小麥種子萌發(fā)的抑制作用卻弱于SZ5 發(fā)酵液。由于發(fā)酵液中混有NA 培養(yǎng)液，且NA 培養(yǎng)液對油菜和小麥種子萌發(fā)亦有明顯的抑制作用，推測發(fā)酵液對種子萌發(fā)的抑制可能更多與NA培養(yǎng)液中的成分有關(guān)。

表4 SZ5 和DLJ1 菌劑發(fā)酵液中植物激素相關(guān)檢測結(jié)果Table 4 Plant hormone related detection results of SZ5 and DLJ1 fermentation broth

萌發(fā)期乙烯的主要作用并不是促進(jìn)種子萌發(fā)，而是通過三重反應(yīng)提高幼苗的頂土能力[19]。在幼苗出土后如果仍有大量乙烯產(chǎn)生，這些過量乙烯將會(huì)抑制幼苗生長[18]。此時(shí)微生物產(chǎn)生的ACC 脫氨酶就可以通過降解ACC 來降低乙烯產(chǎn)生量，減少乙烯對幼苗生長的抑制，促進(jìn)幼苗生長[18]。ACC 脫氨酶活性越強(qiáng)，其促生能力也將越強(qiáng)[16]。這可能是產(chǎn)ACC 脫氨酶微生物的促生機(jī)制[16]，也是本試驗(yàn)中萌發(fā)期DLJ1處理對油菜和小麥萌發(fā)苗生長的促生作用強(qiáng)于SZ5 處理的主要原因。

伴隨著種子萌發(fā)，植物根際有一短暫的ACC 分泌峰出現(xiàn)[19]。產(chǎn)ACC 脫氨酶的微生物可以利用ACC 作為唯一N 源生長。在萌發(fā)期接種菌劑，由于種子萌發(fā)期ACC 分泌峰的出現(xiàn)，使得產(chǎn)ACC 脫氨酶活性越強(qiáng)的微生物可以獲得更多的營養(yǎng)，可能會(huì)使得內(nèi)生菌在植物根際生長繁殖能力更強(qiáng)，進(jìn)而對植物生長產(chǎn)生更大影響；在種子萌發(fā)后接種菌劑，此時(shí)根際ACC 分泌峰已經(jīng)過去，產(chǎn)ACC 脫氨酶的微生物可利用的ACC 量減少，可能導(dǎo)致這類微生物在植物根際的定殖能力減弱，進(jìn)而影響其促生功能的發(fā)揮。這可能是種子萌發(fā)后接種內(nèi)生菌促生效應(yīng)較低的原因。

2.3.2 菌劑產(chǎn)Fe 載體能力 DLJ1 的MSA 發(fā)酵液發(fā)出藍(lán)綠色熒光，在415 nm 處具有明顯的吸收峰；SZ5 的MSA 發(fā)酵液既不產(chǎn)生熒光，在415 nm 處也無光吸收（表5）。表明DLJ1 具有產(chǎn)生Fe 載體的能力，而SZ5無此能力。一方面，F(xiàn)e 載體有利于微生物從周圍環(huán)境吸收Fe，造成周圍Fe 缺乏，從而抑制病原微生物生長，間接促進(jìn)植物生長[20]；另一方面，F(xiàn)e 載體還可為植物提供Fe 營養(yǎng)，直接促進(jìn)植物生長[20]。雖然DLJ1 處理對油菜和小麥的促生作用大于SZ5 處理，但是否與其具有產(chǎn)Fe 載體能力有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。但可以預(yù)測，DLJ1 在抑制需Fe 量較高的病原微生物上可能具有一定作用。

表5 SZ5 和DLJ1 菌劑產(chǎn)Fe 載體能力檢測Table 5 Detection of siderophore production ability of SZ5 and DLJ1

3 結(jié)論與討論

在種子萌發(fā)試驗(yàn)中，SZ5 和DLJ1 菌劑的各培養(yǎng)液處理不僅無法促進(jìn)油菜和小麥種子萌發(fā)，而且NA 培養(yǎng)液和2 個(gè)菌劑發(fā)酵液處理還顯著延緩了種子的萌發(fā)速度。隨著種子萌發(fā)與生長，DLJ1 發(fā)酵液處理顯著促進(jìn)了油菜萌發(fā)苗根、莖、葉的生長以及小麥萌發(fā)苗根系的伸長，其促生效果優(yōu)于其菌懸液處理和SZ5 發(fā)酵液處理；SZ5 各處理中僅菌懸液處理對小麥萌發(fā)苗有一定的促生作用。在幼苗生長試驗(yàn)中，種子萌發(fā)后再進(jìn)行內(nèi)生菌接種處理，培養(yǎng)6 d 后發(fā)現(xiàn)其對幼苗生長的促進(jìn)作用較小。通過對2 個(gè)菌劑發(fā)酵液成分以及產(chǎn)Fe 載體能力進(jìn)行檢測，推測DLJ1 處理促生作用優(yōu)于SZ5 處理可能與其分泌的ACC 脫氨酶活性高以及具有產(chǎn)Fe 載體能力有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，DLJ1 菌劑在油菜生產(chǎn)上可能有一定的應(yīng)用前景，同時(shí)建議在萌發(fā)期進(jìn)行DLJ1 菌劑處理可能效果更好。