苦參堿調(diào)控肝癌細胞HepG2自噬作用機制研究

郭 浩，周淑妮，冉瑞智

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

全球每年有超過60萬患者死于肝癌，其中50%發(fā)生在中國[1-2]。目前，肝癌的有效治療方法是手術(shù)切除和肝移植，再輔助放射治療、化學(xué)治療（簡稱放化療），但患者5年生存率僅為5%[3]。加之大部分肝癌患者合并肝硬化，限制了化療藥物的使用[4]，有必要尋找同時具有抗腫瘤和抗纖維化活性的藥物。目前，苦參堿已被廣泛應(yīng)用于肝炎、肝纖維化、癌癥等疾病的治療[5]，但對其抗腫瘤作用的確切機制研究還不夠深入[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生Ⅱ型程序性死亡，即自噬[8]，但機制尚不清楚。有研究證實，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路在腫瘤細胞自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。本研究中將不同劑量苦參堿作用于肝癌細胞HepG2，確認肝癌細胞HepG2是否發(fā)生了自噬，同時初步探討其分子機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試藥：苦參堿（西安天園生物制劑公司，批號為16092317，純度≥99%）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號分別為PM150210B，164210-100）；胰酶（美國 Gibco公司，批號為 11080907）；單丹磺酞戊二胺（MDC，美國 Sigma公司，批號為15596018）；Trizol ReagentRNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司，批號為15596018）；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司，批號為RR047A）；熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程<大連>有限公司，批號為TK08045）；細胞蛋白抽提試劑（碧云天生物技術(shù)研究所，批號為P0033）；鼠抗p-Akt（Ser473）抗體，兔抗 Akt、mTOR、自噬相關(guān)蛋白 LC3B 抗體，均購自美國Santa Cruz公司，批號分別為HZ-0670R2，HZ-0670R1，HZ-0670R22，HZ-0673R6；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記抗兔IgG和鼠抗GAPDH抗體均購自武漢艾美捷科技有限公司（批號分別為 115-035-003，C1313）。

儀器：TE2000-U+PXM1200型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；MCO-15AC型CO2細胞培養(yǎng)箱和 NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo Revco公司）；CFX96型 PCR 儀 Mini-PROTEAN Tetra型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；ChemiDoc TMXRS型凝膠成像儀（美國UVP公司）。

細胞：肝癌細胞HepG2，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫，批號為CM-1250。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)及分組：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)肝癌細胞HepG2，隔天換液，取處于對數(shù)生長期的肝癌細胞HepG2，分為對照組及苦參堿低、中、高劑量組，待細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入終質(zhì)量濃度依次為0，0.5，1.0，2.0 g/L的苦參堿，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細胞。

MDC染色觀察自噬體：取培養(yǎng)細胞加入MDC（終濃度為50 μmol/L），室溫避光染色10 min后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，再加入無MDC的DMEM培養(yǎng)基，在380 nm波長處觀察細胞染色情況。自噬細胞質(zhì)呈綠色熒光亮點。

RT-PCR法檢測 Akt、mTOR和 LC3B mRNA表達：取培養(yǎng)細胞，5 000 r/min離心5 min，以Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH引物為內(nèi)參。Akt上游 5′-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3′，下 游 5′-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3′；mTOR上游 5′-AGAAGGGTCCCAGCTA-3′，下游 5′-TATTC GGGGTGATCGG-3′；LC3B 上 游 5′-ACTGGATTTGC GGCATGTGA-3′，下游 5′-CCATGTTGAAGTAGGAGC GAGTGA-3′；GAPDH 上游 5′-TCCCATCACCATCTTC CAG-3，下游 5-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′；PCR條件95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次，72℃延伸5 min終止反應(yīng)。讀取循環(huán)閾值（Ct值），采用2-△△Ct表示目的基因mRNA的 表 達 量。以 Akt/GAPDH，mTOR/GAPDH，LC3B/GAPDH比值分別代表各自的相對表達水平，各組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

Western Blot法檢測 Akt、p-Akt、mTOR 和 LC3B蛋白水平：取培養(yǎng)細胞，5 000 r/min離心5 min，洗滌2 次，加入 1 μL PMSF，加入蛋白抽提試液，冰浴 2 h；4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液，檢測蛋白含量；調(diào)整蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水變性，進行電泳、轉(zhuǎn)膜；加入一抗，4℃下孵育過夜，回收一抗，清洗加入二抗，加入發(fā)光試劑，顯影、定影、清洗，將目的條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比為各目的蛋白相對表達水平，各組設(shè)3個平行樣，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行單因素方差分析；組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對細胞自噬行為的影響

結(jié)果見圖1。與對照組比較，苦參堿高、中、低劑量組肝癌細胞HepG2熒光強度明顯增強，且與劑量呈正相關(guān)，說明苦參堿誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2發(fā)生了自噬。

2.2 對細胞AKT和 p-Akt蛋白表達的影響

結(jié)果見表1。與對照組比較，苦參堿高、中、低劑量組肝癌細胞HepG2 Akt mRNA和蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05），肝癌細胞HepG2p-Akt蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），且與劑量呈正相關(guān)。

2.3 對細胞mTOR mRNA和蛋白表達的影響

結(jié)果見表2。與對照組比較，苦參堿高、中、低劑量組肝癌細胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），且與劑量呈正相關(guān)。

2.4 對肝癌細胞HepG2 LC3B表達的影響

結(jié)果見表3。與對照組比較，苦參堿高、中、低劑量組肝癌細胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P<0.05），且與劑量呈正相關(guān)。

圖1 苦參堿誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2自噬行為（×320，箭頭標(biāo)記處為自噬體）

表1 各組肝癌細胞HepG2 Akt和 p-Akt蛋白表達水平比較（±s，n=3）

表1 各組肝癌細胞HepG2 Akt和 p-Akt蛋白表達水平比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P<0.05。表2、表3同。

組別對照組苦參堿 低劑量組中劑量組高劑量組質(zhì)量濃度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 Akt mRNA 1.02±0.06 0.98±0.03 1.04±0.03 1.02±0.05 Akt蛋白1.67±0.23 1.84±0.18 1.73±0.22 1.77±0.31 p-Akt蛋白1.11±0.17 0.83±0.14*0.57±0.06*0.39±0.05*

表2 各組肝癌細胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=3）

表2 各組肝癌細胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=3）

組別對照組苦參堿 低劑量組中劑量組高劑量組質(zhì)量濃度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 mTOR mRNA 0.98±0.04 0.85±0.08*0.63±0.06*0.46±0.07*mTOR蛋白1.12±0.12 0.97±0.13*0.79±0.09*0.36±0.06*

表3 各組肝癌細胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=3）

表3 各組肝癌細胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表達水平比較（±s，n=3）

組別對照組苦參堿 低劑量組中劑量組高劑量組質(zhì)量濃度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 LC3B mRNA 1.00±0.03 1.63±0.16*2.57±0.32*3.15±0.37*LC3B蛋白0.16±0.03 0.28±0.05*0.71±0.16*1.55±0.22*

3 討論

苦參堿是一種從豆科槐屬植物中提取的生物堿，主要從苦參、苦豆子中提取，在肝炎、肝纖維化、腫瘤治療等方面有重要價值[10]。目前，我國已批準(zhǔn)了多種含有苦參堿成分的藥物，臨床藥理試驗結(jié)果顯示，對中晚期肝癌患者給予苦參堿注射液能顯著提高抗腫瘤效果，延長生存時間和改善生活質(zhì)量[11]。體外研究顯示，苦參堿能抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞凋亡[12]。同時，研究苦參堿誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程時，發(fā)現(xiàn)苦參堿還可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生大量的自噬體，出現(xiàn)自噬現(xiàn)象[13]。

自噬現(xiàn)象廣泛存在于真核細胞的生物學(xué)過程中，是細胞在應(yīng)激狀態(tài)下的自我消化過程，作為一種細胞程序性死亡，對體內(nèi)細胞合成和降解穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義[14]。自噬是一把“雙刃劍”，抑制自噬可促進腫瘤細胞持續(xù)增殖，同時，當(dāng)無法提供腫瘤生長所需的足夠營養(yǎng)時，自噬體通過降解腫瘤細胞的蛋白或細胞器來提供能量，維持機體或細胞的生存[15]。自噬泡的形成是自噬的關(guān)鍵步驟，通常通過形態(tài)學(xué)和特殊標(biāo)志分子檢測細胞的自噬情況，形態(tài)學(xué)檢測通常用MDC染色進行，細胞中LC3B含量與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿處理后肝癌細胞HepG2熒光強度明顯增強，且與劑量呈正相關(guān)，說明苦參堿誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2發(fā)生了自噬；同時，LC3B mRNA和蛋白表達水平隨苦參堿劑量增加而升高，也驗證了肝癌細胞HepG2發(fā)生了自噬。

近年有研究發(fā)現(xiàn)，很多抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬，甚至直接導(dǎo)致腫瘤細胞自噬性死亡，故認為自噬現(xiàn)象是治療腫瘤的一種新途徑[17]。目前對自噬現(xiàn)象分子機制的研究還處于框架階段，PI3K/Akt/mTOR通路被認為是細胞自噬的主要調(diào)控途徑[18]。PI3K可磷酸化磷脂酰肌醇4-磷酸和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，產(chǎn)物可激活A(yù)kt，Akt是PI3K/Akt/mTOR通路下游主要的效應(yīng)分子，當(dāng)其磷酸化被抑制時促進細胞自噬的發(fā)生[19]。mTOR是細胞自噬的負調(diào)控因子，抑制自噬的發(fā)生，發(fā)揮“門衛(wèi)”作用。研究證明，通過抑制mTOR可促進HeLa細胞、肝癌細胞HepG2等自噬[20]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿處理后肝癌細胞HepG2內(nèi)Akt mRNA和蛋白表達變化不明顯，但Akt的磷酸化被明顯抑制，同時，mTOR也受到抑制，與之前的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，苦參堿可促進肝癌細胞HepG2的自噬作用，其機制與抑制PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)。