肝癌肝移植預后的分子標志物研究進展

羅方舟，楊喆，鄭樹森，2

（1.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，杭州 310003；2.浙江樹人學院樹蘭國際醫(yī)學院附屬樹蘭（杭州）醫(yī)院 肝膽胰外科，杭州 310000）

肝細胞肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中占第6位，腫瘤導致的死亡率占第4位。雖然目前肝癌的發(fā)病率有所下降，但是全球范圍內(nèi)每年仍有約84萬新發(fā)病例[1]。手術切除與肝移植是目前公認的治療肝癌有效手段。在我國，由于龐大的乙型肝炎病毒感染人群，導致大多數(shù)肝癌患者往往伴有乙型病毒性肝炎后肝硬化的背景，部分患者無法耐受手術切除，肝移植成為了最佳選擇。肝移植不僅能夠徹底根治腫瘤，并且能夠完全治愈肝硬化。經(jīng)過長期的發(fā)展，肝移植的成功率達到60%～80%[2-3]。然而，肝移植術后腫瘤復發(fā)轉移制約了肝癌肝移植患者的長期預后，符合米蘭標準的受體肝移植術后腫瘤復發(fā)轉移約為10%～20%。對于進展期肝癌患者肝移植，其術后1年內(nèi)的腫瘤復發(fā)可達30%～60%，其5年生存率僅30%[4]。因此，早期識別肝癌復發(fā)的危險因素，篩選出高特異性、高敏感性的新型腫瘤標志物，從分子生物學層面建立肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)轉移的早期預警體系，盡早進行臨床干預以期延長患者的無瘤生存期是肝癌肝移植的主要研究方向。本文將分別從蛋白質(zhì)、轉錄組學、傳統(tǒng)的腫瘤標志物、肝炎病毒以及免疫學指標等方面的研究進展進行綜述。

1 肝癌復發(fā)轉移相關蛋白

1.1 骨橋蛋白（osteopontin，OPN）

OPN是一種鈣合磷酸化的糖蛋白，廣泛分布于人體內(nèi)多種組織及細胞中，能夠參與細胞代謝、組織修復，可促進細胞間的黏附、遷移[5]。在正常的肝臟組織中，OPN主要在膽管上皮細胞、星狀細胞及Kupffer細胞中表達，并不在肝細胞中表達[6]。OPN與肝癌的復發(fā)轉移關系密切，肝癌中OPN的表達水平往往與腫瘤直徑、包膜侵犯、淋巴轉移、肝內(nèi)轉移、血管侵犯以及較差的病理分型成正相關[7-9]。Kim等[10]應用ELISA法檢測62例肝癌患者、60例肝硬化患者以及60例健康人群的血清OPN，發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血清OPN水平明顯高于肝硬化患者及健康人群，提示血清OPN是一種良好的腫瘤標志物。Sieghart等[11]回顧性分析了125例肝癌肝移植患者術后的OPN水平變化，發(fā)現(xiàn)OPN可以作為預測肝移植術后腫瘤復發(fā)的標志物。Ye等[12]對肝癌的基因表達研究中發(fā)現(xiàn)，OPN在轉移性肝細胞肝癌中存在過表達，進一步動物實驗發(fā)現(xiàn)，在高轉移性肝癌裸鼠模型中，加入OPN特異性抗體能夠有效抑制肝細胞肝癌肺轉移，因此可推測OPN具有促進肝癌轉移的能力。Pan等[8]分析了大量肝癌切除術后的腫瘤樣本中的OPN mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)OPN mRNA的高表達與腫瘤直徑、較晚的腫瘤分期、早期復發(fā)、偏低的10年生存率相關，OPN的高表達對腫瘤的復發(fā)轉移具有較好的預警作用。因此繼續(xù)研究OPN與肝癌肝移植后腫瘤的復發(fā)轉移的關系具有重要的意義。

1.2 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）

β-catenin是由CTNNB1基因編碼的蛋白，具有介導細胞黏附以及信號轉導的功能[13]。正常細胞中β-catenin與E-cadherin分子的胞內(nèi)區(qū)域相結合，在同型細胞互相黏附中扮演重要角色。此外，β-catenin還是Wnt信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子。β-catenin的突變與肝臟相關疾病的關系尤為密切，在肝臟炎癥、肝纖維化以及肝細胞肝癌的發(fā)生中都有β-catenin的異常[14]。Huang等[15]在丙肝相關肝癌中發(fā)現(xiàn)，約41%的腫瘤組織中可以檢測到β-catenin基因的突變，并且在所有的β-catenin基因突變肝癌組織中均可檢測到β-catenin蛋白在細胞核內(nèi)的異常聚集，據(jù)此推測肝癌細胞中β-catenin的激活可能是腫瘤發(fā)生的重要因素之一。另外，還有許多研究顯示，各種方式誘導的動物肝癌模型中β-catenin均有異常聚集[16-17]。Fiorentino等[18]對83例肝癌肝移植患者進行術后隨訪發(fā)現(xiàn)，β-catenin的表達與患者術后的復發(fā)轉移密切相關，并且β-catenin可作為獨立預測移植術后腫瘤復發(fā)的獨立危險因子。β-catenin除了可以通過Wnt通路導致細胞的惡性轉化外，還可以通過影響細胞間的黏附促進腫瘤的轉移。Endo等[19]發(fā)現(xiàn)對比肝癌與癌旁組織，β-catenin高表達與E-cadherin的低表達密切相關，且β-catenin的高表達與血管侵犯密切相關，提示我們β-catenin可能通過與E-cadherin的作用促進肝癌血管侵犯進而促進腫瘤轉移。在肝癌肝移植領域中，從信號轉導以及臨床預后分析角度來看，β-catenin可作為病肝的檢驗指標用以指導患者術后的治療方案。

1.3 高爾基體蛋白-73（Glycoprotein 73，GP-73）

GP-73是一種位于高爾基體順面的磷酸化跨膜蛋白，由Kladney等[20]發(fā)現(xiàn)，由于其在SDS-PAGE中顯示相對分子量為73 kD，且定位于高爾基體上，故命名為高爾基體蛋白-73。在肝臟中，GP-73主要表達于膽管上皮細胞，很少表達于肝細胞中，在肝臟病變的情況下導致GP-73被切割并釋放入血，因此血清GP-73升高提示肝臟受損。在肝癌組織中，GP-73被發(fā)現(xiàn)較癌旁組織明顯升高[21]。Wei等[22]對比了肝癌組患者、肝硬化組患者、慢性肝炎組患者以及健康人群中血清GP-73的含量，與健康人群的標本相比肝癌組的相對值為17.15，肝硬化組的相對值為5.69，慢性肝炎組患者為3.01，差異顯著。Marrero等[23]亦發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血清GP-73水平要明顯高于肝硬化患者，GP-73的診斷肝癌的特異度和靈敏度分別為75%、69%。在AFP陰性的肝癌患者中，約有53%的肝癌患者GP-73明顯升高，說明其對早期肝癌的診斷具有十分重要的意義。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)GP-73與腫瘤的增殖具有聯(lián)系，在干擾GP-73的表達后肝癌細胞系HepG2與BEL-7402的增殖率大幅下降，可達到約50%。但是在另外兩項實驗中敲低GP-73的表達后，肝癌細胞系的增殖率下降趨勢并不明顯[25-26]。因此GP-73與肝癌細胞的增殖方面仍需進一步的探究。

1.4 α-L-巖藻糖苷酶（alpha-L-fucosidase，AFU）

AFU是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體的組織細胞當中，以肝、腎分布最為廣泛，在機體中主要起催化分解含巖藻糖基的糖蛋白、糖苷作用。AFU作為肝癌的腫瘤標志物是首先由Morris等在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)的，他們發(fā)現(xiàn)在小鼠的肝癌組織樣本中，AFU的活性較正常肝臟組織高了近7倍，且與腫瘤的生長相關。之后法國學者Deugnier等[27]在3例肝癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)AFU明顯升高，并提出可將AFU作為肝癌診斷的生物學標志物。自AFU被發(fā)現(xiàn)與肝癌相關以來，各種研究層出不窮。有國內(nèi)研究顯示血清AFU對肝癌的診斷陽性率在64%～84%之間，特異度在90%，且患者血清的AFU變化與AFP無明顯的相關性[28]。Frawzy等[29]分別對比了肝癌患者、肝硬化患者以及健康對照人群的血清AFU水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者的AFU水平要明顯高于其它兩組。Wang等[30]通過回顧性分析669例肝癌患者的病理學資料與臨床資料發(fā)現(xiàn)，AFU可以作為一個獨立的預后預測因子，患者術前AFU＞35 U/L的患者術后肝癌更容易復發(fā)。因此AFU作為預測肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)方面具有一定的價值。

2 肝癌復發(fā)轉移的轉錄組學研究進展

2.1 微小RNA（microRNA，miRNA）

miRNA是指一類長度約為19～25 nt沒有編譯功能的單鏈RNA，miRNA可在轉錄后水平調(diào)控基因的表達，通過堿基互補配對與相應的靶mRNA結合，誘導其剪切或抑制其翻譯[31]。miRNA在腫瘤的研究中占有重要的地位，大量的研究揭示miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復發(fā)轉移中占有重要的地位。miRNA可作為許多腫瘤的潛在生物學標志物，如前列腺癌、肺癌、胃癌等[32-34]。在肝癌的研究中，大量的miRNA被報道。如miR-125b-5p與miR-15b-5p被發(fā)現(xiàn)與細胞的惡性增殖有關，且早期便在肝癌血清樣本中高表達，可作為早期診斷肝癌的標志物[35]。再者，如miR-101-3p、miR-224-5p以及miR-483-5p被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞抵抗凋亡有關，miR-101-3p在肝癌組織中顯著降低，而miR-224-5p和miR-483-5p則被發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)[36-38]。Peng等[39-40]在肝癌肝移植患者的組織樣本中發(fā)現(xiàn)miR-203與miR-155與患者的預后顯著相關，miR-203在術后復發(fā)的肝癌組織中表達量要明顯低于無復發(fā)的肝癌組織，結合患者的預后分析發(fā)現(xiàn)，miR-203高表達的移植受體術后的無瘤生存期與總體生存率明顯高于低表達組的患者；另外，miR-155被發(fā)現(xiàn)在復發(fā)的肝癌組織樣本中表達量要明顯高于無復發(fā)的肝癌組織樣本，且高表達miR-155的受者預后明顯不如低表達組。Yang等[41]發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p在肝癌組織中低表達，其生物學功能可通過HGF-cMet通路抑制腫瘤血管的形成，可作為移植術后患者的預后評判指標。miRNA在肝癌的研究中還有許多尚未被挖掘，目前為止大多數(shù)的研究距離實際應用仍有較長的路要走，對miRNA的調(diào)控腫瘤方式研究較為廣泛，然而尚未發(fā)現(xiàn)某個miRNA具有實際的臨床應用價值，還需要更多的臨床樣本進行進一步的探究。

2.2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）

lncRNA是指一類長度超過200 nt的非編碼RNA，其自身并不編碼蛋白質(zhì)，在很長一段時間里被認為是轉錄的廢物，沒有生物學功能。近年來研究顯示，lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、細胞分化與細胞周期的調(diào)控中起重要作用，可通過調(diào)節(jié)基因表達從而影響細胞的生命活動[42]。隨著腫瘤研究的深入，lncRNA同樣在腫瘤的調(diào)控中扮演極其重要的角色，因而lncRNA也可以作為潛在的腫瘤分子標志物。Konish等[43]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT-1的血清濃度與肝臟損傷相關，可以提示肝癌的發(fā)生。同時Yang等[44-45]闡明lncRNA MALAT-1與HOTAIR通過影響肝癌細胞的增殖、凋亡，增加侵襲性與轉移能力從而促進腫瘤的轉移、播散，高表達MALAT-1與HOTAIR提示移植術后患者的不良預后及高危復發(fā)風險。另外，還有許多肝癌相關的lncRNA被不斷發(fā)現(xiàn)，如H19、lncRNA-HEIH、lncRNA-HULC、TUC338等[46-48]。由此可見，lncRNA在肝癌患者的預后中占據(jù)重要地位，目前仍有許多l(xiāng)ncRNA的作用機制尚未被闡明，lncRNA亦可作為腫瘤標志物檢測肝癌肝移植術后患者的病情變化。

3 傳統(tǒng)腫瘤標志物

3.1 甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）

AFP是目前臨床上應用最為廣泛的肝癌血清學標志物，屬于血清白蛋白家族。正常的成年人幾乎不表達AFP，正常情況下，AFP主要由胚胎的肝臟組織產(chǎn)生、分泌，參與許多重要的分子轉運過程[49]。因此在妊娠期孕婦的血清AFP水平可有所升高，但產(chǎn)后會迅速下降，達到最低值。目前AFP應用于診斷肝細胞肝癌的標準為：血清濃度≥20 ng/mL為AFP陽性，提示肝癌可能；若AFP≥400 ng/mL則是確診肝癌的重要標準之一。AFP除了應用于肝癌的診斷上，亦被應用于肝癌肝移植的受體選擇上。Mazzafero等[50]于1996年提出了經(jīng)典的米蘭標準，即單個腫瘤直徑不超過5 cm；或腫瘤總數(shù)不超過3個，最大直徑小于3 cm，無血管侵犯，無淋巴轉移以及肝外轉移。符合米蘭標準的患者肝移植后取得了良好的預后，4年無瘤生存率可達到92%。然而米蘭標準對受體的選擇過于苛刻，導致許多患者失去肝移植手術的機會。為進一步擴大移植受體的范圍，Yao等[51]于2001年提出了UCSF標準，將單個最大腫瘤直徑擴大為6.5 cm，多發(fā)最大腫瘤直徑擴大到4.5 cm，擴展了肝癌肝移植的受體人群，且長期預后與米蘭標準相比并無明顯差異。米蘭標準與UCSF標準對肝癌肝移植具有重大的意義，但是它們均局限在腫瘤的大小與數(shù)目上，沒有考慮肝癌的生物學特性。我們團隊于2006年提出了適合國情的杭州標準，即肝癌累計直徑小于8 cm，或者腫瘤總直徑超過8 cm，但是血清AFP水平≤400 ng/mL，且病理學分級為中高分化者也可行肝移植。杭州標準的提出顯著增加了肝移植的受益人群，且術后3年存活率達到70.7%，與米蘭標準相比無明顯差異。AFP除了可應用與肝癌肝移植術前受體選擇上，亦可應用于患者肝移植術后的腫瘤復發(fā)轉移動態(tài)監(jiān)測中。N?rthen等[52]通過回顧性分析63例肝癌肝移植患者的預后，發(fā)現(xiàn)術后1、3、5年的AFP分別超過7、6、6 μg/L提示患者術后不良預后，具有預警術后肝癌復發(fā)作用。我們團隊通過分析本中心肝癌肝移植患者的AFP與18F最大吸收值，發(fā)現(xiàn)術后3個月、半年AFP≤1 000 ng/mL以及SUVmax＜5的患者預后較其他高AFP及SUVmax組的患者預后更好，1年生存率可達73.3%，提示AFP結合其他檢查結果可以成為很好的術后預測肝癌復發(fā)轉移指標。

3.2 脫-γ-羧基凝血酶原（des-γ-carboxy prothrombin，DCP）

DCP是一種異常的凝血酶原，最先由Liebman等[53]于1984年報道，相比于正常的凝血酶原，DCP中一個或多個谷氨酸的殘基不能被羧基化，導致DCP無法與鈣離子相結合，因而無法發(fā)揮正常的凝血功能。Inagaki等[54]發(fā)現(xiàn)在肝癌的患者中，DCP的血清濃度明顯與腫瘤的分期、病灶的大小、門脈有無癌栓形成等密切相關。日本學者在活體肝移植中發(fā)現(xiàn)，肝癌肝移植患者術前DCP＞400 mAU/mL是患者術后腫瘤復發(fā)的獨立危險因素[55]。據(jù)此，Ito等[56]將DCP納入肝癌肝移植受體的選擇標準中，并提出了肝癌肝移植京都標準，即腫瘤數(shù)量≤10個，腫瘤直徑≤5 cm，血清DCP≤400 mAU/mL。多項研究顯示DCP在肝癌患者的血清及組織中特異性表達，Marrero等[57]通過分析西方人群研究發(fā)現(xiàn)DCP在鑒別肝癌與肝硬化、慢性肝炎的特異性與敏感性分別為95%和89%。國內(nèi)付水等[58]通過對肝癌患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者以及健康人群的血清DCP與AFP對比研究發(fā)現(xiàn)DCP診斷肝癌的特異度與敏感度分別為89.57%與77.36%，而AFP的特異度與敏感度分別為77.91%與60.38%。由此可見DCP在鑒別診斷肝癌、肝硬化以及慢性肝炎具有更高的價值。當然亦有研究認為DCP的臨床診斷價值有限，對早期肝癌的診斷敏感度僅為56%[59]。DCP除了在診斷肝癌方面具有價值外，亦有研究指出DCP具有促進腫瘤發(fā)展、轉移的作用。Gao等[60]通過體外實驗與小鼠實驗發(fā)現(xiàn)DCP具有促進肝癌細胞VEGF、TGF-α、bFGF的表達水平，在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)DCP具有促進腫瘤組織惡性增殖的能力，并且能夠增加腫瘤組織的微血管密度。由此可見DCP亦可作為肝癌治療的靶點。我們團隊通過對肝移植術后患者的血清學檢查分析發(fā)現(xiàn)，術后3個月DCP與AFP均為陰性的患者術后總生存率最高，DCP與AFP均陽性的患者術后總體生存率最低，AFP與DCP單個血清學指標陽性的患者生存率居中。由此可見，無論是在術前肝移植受體的選擇還是術后腫瘤復發(fā)、轉移的監(jiān)測，甚至是肝癌治療方面，DCP都具有極高的價值，是良好的預警指標。

4 免疫-炎癥-腫瘤相關生物學標志物

近年來，隨著程序性死亡受體-1及其配體（programmed death protein-1/ligand1，PD-1/L1）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制被不斷的闡明，腫瘤的免疫療法不斷的興起，腫瘤免疫學成為了一個極具發(fā)展?jié)摿Φ念I域。PD-1/L1是CD28/B7超家族的新成員，具有負性調(diào)節(jié)免疫相關細胞的作用，PD-1分子可在活化的T、B細胞以及巨噬細胞表面高表達，而在腫瘤組織中，PD-1的高表達可使淋巴細胞的腫瘤殺傷能力降低，從而導致腫瘤細胞的免疫逃逸[61-62]。隨著對腫瘤免疫的研究深入，可溶性PD-1（sPD-1）被發(fā)現(xiàn)，并被證明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。然而，關于sPD-1的產(chǎn)生、表達的特征以及作用機制目前報道很少。Nielsen等[63]在活化的T細胞中發(fā)現(xiàn)了多種PD-1的mRNA剪接變異體，發(fā)現(xiàn)了一種缺失編碼PD-1分子的跨膜區(qū)的mRNA，推測其可能與sPD-1的產(chǎn)生有關。Zhu等[64]利用sPD-1的ELISA試劑盒分別對肝癌患者、慢性乙肝感染患者、乙肝肝硬化患者以及健康對照人群的外周血樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌患者外周血的sPD-1明顯低于肝硬化患者、慢性乙肝感染患者，且外周血的sPD-1水平與腫瘤的分期呈負相關。Onlamoon等[65]在動物實驗中通過基因工程使sPD-1蛋白與PD-L1相結合，發(fā)現(xiàn)sPD-1可以封閉腫瘤細胞表面的PD-L1，從而避免了淋巴細胞的耗竭。由此可見，分泌型的PD-1可以反應機體對腫瘤細胞的免疫狀態(tài)，具有很好的預測腫瘤復發(fā)轉移的免疫分子的前景。

炎癥在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中已被廣泛研究，已有研究顯示慢性炎癥與腫瘤的復發(fā)轉移密切相關[66]。外周血的中性粒細胞與淋巴細胞的比值能夠很好的反應機體的炎癥與免疫狀態(tài)。研究顯示中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil and lymphocyte ratio，NLR）的截斷值為5，與結直腸癌、肝癌的腫瘤的術后復發(fā)轉移密切相關，患者術后NLR≥5往往提示不良的預后[67-68]。肝癌肝移植中，Halazun等[69]分析了150例肝移植受體術前的NLR，發(fā)現(xiàn)術前高NLR（≥5）的患者移植術后肝癌復發(fā)的風險比低NLR組患者明顯升高，且在米蘭標準內(nèi)，高NLR患者的預后較低NLR患者的預后較差。可見NLR這一容易獲取的指標具有很好的預測作用。Chen等[70]根據(jù)101例乙肝相關肝癌肝移植患者的術前NLR進行研究分析發(fā)現(xiàn)NLR≥3的受者人群術后肝癌轉移復發(fā)率更高，認為NLR≥3是判斷患者整體慢性炎癥的截斷值。針對患者移植術后腫瘤復發(fā)的檢測，我們團隊回顧分析了100余例肝癌肝移植患者，發(fā)現(xiàn)術后AFP與NLR聯(lián)用能夠很好的預測患者的長期預后，并發(fā)現(xiàn)術后3個月患者的NLR≥7提示患者的不良預后。NLR在預測肝移植術后的復發(fā)轉移中仍有較大的探索空間，對于NLR的cut-off值仍需進一步多中心、大樣本的研究、探索。

5 乙型肝炎病毒感染

在我國，由于乙型肝炎病毒的廣泛流行，大部分肝癌患者都有乙型肝炎病毒感染的背景，乙型肝炎病毒感染相關肝癌約占所有肝癌的70%～85%[71-72]。因此明確乙型肝炎病毒與移植后腫瘤復發(fā)的關系顯得尤為重要。已有研究表明，肝移植術后高乙型肝炎病毒負荷是術后腫瘤復發(fā)的高危因素。Campsen等[73]研究發(fā)現(xiàn)肝癌肝移植術后乙型肝炎病毒再感染的人群腫瘤復發(fā)是未感染人群的3.6倍，術后積極抗病毒治療，預防乙型肝炎病毒再感染能夠有效地延長患者的無瘤生存期。由此可見，術后乙型肝炎病毒再感染以及高負荷的乙型肝炎病毒載量是患者移植術后腫瘤復發(fā)的危險因素。因此應當將抗病毒治療及檢測納入肝癌肝移植的常規(guī)治療措施中。

6 展望

隨著我國肝移植事業(yè)的不斷發(fā)展，越來越多的難以手術切除病灶的肝癌患者獲得根治性治療的機會。然而，肝癌肝移植術后肝癌復發(fā)仍然是制約術后患者長期生存的主要影響因素。隨著越來越多的分子標志物被發(fā)現(xiàn)，早期預測肝移植后肝癌的復發(fā)逐漸成為可能，大量的研究聚焦于建議預測肝移植術后肝癌復發(fā)模型上，并且取得了巨大的進步。但是，目前預測肝癌肝移植術后復發(fā)的分子標志物研究仍大多停留于實驗室階段，不足以指導臨床的診治工作。當前的主要工作是進一步尋找新型的預測肝癌復發(fā)轉移的分子標志物，將現(xiàn)有的分子標志物進行多中心、大規(guī)模臨床驗證，建立肝移植術后肝癌復發(fā)轉移的預警體系，對高風險患者進行及時干預，以期延長患者術后的生存期，使患者達到長期存活。