天然柿霜上的真菌多樣性研究

王天琪，孫曉東，王 輝，關(guān)海雯

（大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連116600）

柿餅是一種歷史悠久的休閑食品，距今已有1 000多年的歷史。北魏賈思勰《齊民要術(shù)》中記載：“柿熟時(shí)取之，在灰汁燥再三，度干，令汁絕，著器中，經(jīng)十日可食?！笨梢?jiàn)柿餅源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，直到現(xiàn)在依舊是人們冬季日常生活中的休閑食品，深受消費(fèi)者青睞。柿餅中富含磷、鈣、碘、蛋白質(zhì)和各類維生素，能有效治療腸胃不足，解酒毒，壓胃熱[1]。將成熟柿子去皮后，于日光下晾曬數(shù)日，柿子果肉內(nèi)的成分逐漸外滲，伴隨著水分蒸發(fā)，在其表面逐漸形成干燥的白色結(jié)晶，即柿霜[2]?！侗静菥V目》中記載：“柿霜乃其津液，生津化痰，清上焦心肺之熱，治咽喉口舌瘡?fù)础！笨梢?jiàn)柿霜對(duì)喉痛咽干、口腔炎、肺熱咳痰等癥有非常顯著的療效[3-4]。柿霜的主要成分是糖類，其形成的過(guò)程又是在開(kāi)放的環(huán)境中完成，因此，柿霜中必然蘊(yùn)藏著豐富的真菌資源。本研究從4個(gè)主要柿餅產(chǎn)區(qū)陜西富平、桂林恭城、山東臨朐、山西運(yùn)城采集新鮮制成的柿餅12份，采用直接分離和稀釋分離2種方法對(duì)柿霜上的真菌多樣性進(jìn)行研究，研究結(jié)果為評(píng)價(jià)柿霜的食品安全性及發(fā)現(xiàn)功能性菌株奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

12份柿餅樣品分別采自陜西富平、桂林恭城、山東臨朐、山西運(yùn)城4個(gè)柿餅產(chǎn)地，每個(gè)產(chǎn)地采集3份不同地點(diǎn)的柿餅樣品，每份樣品0.5 kg。在采集時(shí)間上選擇剛剛完成制作并未經(jīng)儲(chǔ)藏的柿餅，最大程度上保證了柿餅樣品的新鮮程度，之后立即拿回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行真菌的分離和培養(yǎng)。

孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；酵母基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純由天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

奧林帕斯CX21顯微鏡出自日本奧林帕斯公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋出自深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)出自蘇州凈化設(shè)備有限公司；6-16KS臺(tái)式高速離心機(jī)出自德國(guó)SIGMA公司；凝膠成像系統(tǒng)出自美國(guó)UVP公司；MG96 PCR儀出自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DY-20D電泳系統(tǒng)出自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分離方法和培養(yǎng)基的選擇 研究采用了直接分離和稀釋分離2種方法。選取孟加拉紅培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基為純化培養(yǎng)基。

直接分離法：仔細(xì)觀察柿餅表面，選擇不同部位用滅過(guò)菌的刀片刮取少量的柿霜置于孟加拉紅培養(yǎng)基上，用滅過(guò)菌的棉簽分散均勻，10℃暗光培養(yǎng)至培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿真菌菌落。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

稀釋分離法：取2支裝有9 mL無(wú)菌水的試管，分別編號(hào)1、2。用上述同樣的方法選取柿餅不同部位刮取柿霜，每個(gè)樣品的刮取量為1 g。將刮取的柿霜放入1號(hào)試管中，使其充分混勻，吸取1 mL溶液放入培養(yǎng)皿中，隨后倒入40℃孟加拉紅培養(yǎng)基，此時(shí)柿霜被稀釋了10倍。吸取1 mL 1號(hào)試管的溶液倒入2號(hào)試管中，混合均勻后吸取1 mL溶液放入培養(yǎng)皿中，隨后倒入40℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，此時(shí)柿霜被稀釋了100倍。10℃暗光培養(yǎng)至培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿真菌菌落。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3.2 菌株的純化和保存 將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上純化，25℃培養(yǎng)7 d。純化后的菌株轉(zhuǎn)入30%的甘油小管80℃溫度條件下長(zhǎng)期保存。

1.3.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)純化后的菌株在顯微鏡下觀察形態(tài)特征，其中產(chǎn)孢方式、產(chǎn)孢細(xì)胞的大小、形態(tài)以及孢子的形態(tài)、大小、隔膜、表面的紋飾等都是重要的分類依據(jù)。菌落特征在鑒定中也可以參考。研究對(duì)分離獲得的所有絲狀真菌都進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定[5-10]，對(duì)無(wú)法鑒定到種的菌株、細(xì)菌和酵母菌均進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 所有菌株的基因組DNA均采用試劑盒提取，提取后的DNA樣品送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序。采用的引物有ITS（ITS1/ITS4）、16S（27F/1492R）和 NL（NL1/NL4）分別擴(kuò)增絲狀真菌、細(xì)菌和酵母菌的特異性區(qū)域。測(cè)序結(jié)果在Genebank里比對(duì)，選取相似度為100%的結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定共獲得真菌20屬30種，研究獲得了1株細(xì)菌Pseudomonas psychrophila，各樣品中的真菌類群詳見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，Penicillium、Cladosporium、Alternaria，這3個(gè)屬的真菌幾乎存在于所有的樣品中，是柿霜上普遍存在的優(yōu)勢(shì)類群，而其他種類Rhizopus、Trichoclerma、Fusarium也大量存在于各地的樣品中。研究獲得了相當(dāng)數(shù)量的酵母菌，其中Metschnikowia、Debaryomyces、Cryptococcus 是 酵 母菌中的優(yōu)勢(shì)類群，存在于多地的樣品中，采自于山西的樣品SX1中同時(shí)分到了這3種酵母。Aureobasidium 存在于 SX3、SD2、G3、FZ1 四個(gè)樣品中，這種菌被報(bào)道可以產(chǎn)生普魯蘭多糖、胞外多聚糖類、胞外酶類、黑色素、β-聚蘋果酸、嗜鐵素、L-山梨醇等一系列物質(zhì)，這些物質(zhì)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、生物防治、化妝品工業(yè)和煙草制造工業(yè)等眾多領(lǐng)域[11]。

從生物量的角度評(píng)價(jià)，山東和富平的樣品分離出的真菌數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于桂林和山西的樣品，而柿霜上物種的多樣性桂林是最少的，其他3個(gè)地區(qū)都擁有相當(dāng)數(shù)量的真菌種類。

研究采用了孟加拉紅培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，從很大程度上抑制了細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，更好地還原了柿霜中真菌的多樣性。unidentified Saccharomycetes是桂林的3個(gè)樣品中分離得到的幾株酵母菌，因?yàn)楸诤駸o(wú)法有效地破壁提取基因組DNA，目前無(wú)法確定其分類地位。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，柿霜中的真菌豐富多樣，以絲狀真菌為主，還有很多種類的酵母菌，不同地區(qū)的樣品都有自己獨(dú)特的真菌組成。這些真菌中的很多類群都參與了食品的發(fā)酵過(guò)程，如Rhizopus在醬油、酒曲的發(fā)酵中被廣泛地應(yīng)用；Debaryomyces被用于紅酒、肉類和奶酪的發(fā)酵生產(chǎn)；Penicillium作為重要的發(fā)酵功能菌株參與到了奶酪、葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)中[12-13]。作為功能性菌株，這些真菌在發(fā)酵過(guò)程中起的作用至關(guān)重要。而存在于柿霜表面的真菌，哪些營(yíng)腐生生活，哪些參與到了柿霜的形成過(guò)程還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，要了解它們的作用還需要進(jìn)行深入的研究。

表1 樣品中檢出的真菌種類