TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中的表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性分析

伊燕軍 徐旭 王真

[摘要] 目的 探討TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性。 方法 以本院2010年4月～2013年7月收治的頜面骨纖維異常增殖癥患者44例為病例組，同期選擇口腔科外傷10例正常新鮮頜骨骨折患者作為對(duì)照組，酶聯(lián)免疫吸附法、免疫組化法測定TWSG1蛋白的表達(dá)，分析TWSG1蛋白在各組中的表達(dá)水平及其與頜面骨纖維異常增殖癥患者臨床特征（性別、影像CT分類、年齡、病變部位、術(shù)后復(fù)發(fā)）的相關(guān)性。 結(jié)果 病例組與對(duì)照組的性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;病例組TWSG1蛋白水平表達(dá)水平為（146.98±15.14）ng/g，高于對(duì)照組（19.87±9.76）ng/g（t=25.281，P<0.01）;病例組TWSG1蛋白陽性率為81.8%，明顯高于對(duì)照組的10.0%（χ2=19.483，P<0.01）;TWSG1蛋白表達(dá)與性別、影像CT分類相關(guān)性不明顯（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;與年齡、病變部位、術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型，TWSG1蛋白陽性表達(dá)率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）;術(shù)后有復(fù)發(fā)頜面骨纖維異常增殖癥患者其TWSG1陽性表達(dá)率為92.8%，高于術(shù)后未復(fù)發(fā)者TWSG1陽性表達(dá)率（62.5%）（χ2=6.308，P<0.05）。 結(jié)論 TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進(jìn)展預(yù)后密切相關(guān)，其機(jī)制可能與TWSG1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化有關(guān)，TWSG1可能成為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] TWSG1;頜面骨;纖維異常增殖癥;臨床特征;相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R782? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）01-0005-04

Expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features

YI Yanjun XU Xu WANG Zhen

Department of Stomatology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features. Methods A total of 44 cases of maxillofacial fibrous dysplasia from April 2010 to July 2013 in our hospital were included in the case group. Ten patients with normal fresh jaw fractures who underwent stomatological trauma were selected as control group in the same period. The expression of TWSG1 protein was measured by enzyme-linked immunosorbent assay and immunohistochemistry. And the expression of TWSG1 protein in each group and its correlation with the clinical features of maxillofacial fibrous dysplasia （sex， CT classification， age， lesion location， postoperative recurrence） was analyzed. Results There was no significant difference in gender， age， smoking， alcohol consumption distribution， BMI， systolic blood pressure and diastolic blood pressure between the case group and the control group（P>0.05）. The expression level of TWSG1 protein in the case group was （146.98±15.14） ng/g， which was higher than that （19.87±9.76） ng/g of the control group （t=25.281， P<0.01）.The positive rate of TWSG1 protein in the case group was 81.8%， which was higher than that of the control group （10.0%） （χ2=19.483， P<0.01）. TWSG1 protein expression was not significantly correlated with gender and imaging CT classification（χ2=0.081， 2.546， P>0.05）， while was significantly correlated with age， lesion location， postoperative recurrence. When the age was less than 20 years old， and lesion location was multi-bone type， the positive rate TWSG1 protein expression was higher （χ2=6.210， 7.283， P<0.05）. The positive expression rate of TWSG1 was 92.8% in patients with postoperatively recurrent maxillofacial fibrous dysplasia， which was higher than that of patients who had no recurrence after surgery（62.5%） （χ2=6.308， P<0.05）. Conclusion TWSG1 is closely related to the prognosis of maxillofacial fibrous dysplasia， and its mechanism may be related to the promotion of osteoblast differentiation by TWSG1. TWSG1 may become a molecular target for the treatment of maxillofacial fibrous dysplasia.

[Key words] TWSG1; Maxillofacial bone; Fibrous dysplasia; Clinical features; Correlation

骨纖維異常增殖癥是一種病因不明、進(jìn)展緩慢、先天非遺傳性的自限性良性骨纖維組織疾病[1-2]。男女均可患病，比例約為1∶2，本病絕大多數(shù)發(fā)生于20歲以前，病因尚不明確，某些原因?qū)е碌木植垦貉h(huán)障礙、內(nèi)分泌功能紊亂、外傷、感染可能與之有關(guān)[3]。由于骨的間質(zhì)分化不良、網(wǎng)狀骨未成熟期骨停滯，在病理上表現(xiàn)為質(zhì)梭形細(xì)胞的纖維組織和發(fā)育不良的網(wǎng)狀骨骨小梁取代正常骨小梁[4]。臨床上頜面骨纖維異常增殖癥的癥狀如下：頜面部的骨區(qū)有畸形腫脹的現(xiàn)象，面部的兩側(cè)不對(duì)稱，鼻腔變窄，眼球有突出和移位狀況，牙齒會(huì)出現(xiàn)松動(dòng)，隨著病情的加重還會(huì)產(chǎn)生頭痛[5]。我國頜面骨纖維異常增殖癥發(fā)病率日漸升高，約有86萬患者，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，每年我國在頜面骨纖維異常增殖癥治療上的支出多達(dá)120億元人民幣，給社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[6]。TWSG1蛋白（Twisted Gastrulation，TWSG1）是一種分子量為23.5 KDA的分泌糖蛋白，在細(xì)胞外空間與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）結(jié)合，發(fā)揮增效和拮抗的作用，進(jìn)而激活成骨細(xì)胞相關(guān)功能[7]。TWSG1蛋白在哺乳動(dòng)物的脂肪組織、血管平滑肌組織、骨骼、心肌組織、胎盤中均有表達(dá)，利用各種受體的分子、生長因子以及多功能蛋白，調(diào)控細(xì)胞的變化過程，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖[8]。本研究擬探討TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性分析，為頜面骨纖維異常增殖癥的治療提供理論及臨床依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年4月～2013年7月在我院口腔頜面外科確診有完整隨訪資料的頜面骨纖維異常增殖癥患者44例，所有患者行輔助檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化檢查，經(jīng)臨床表現(xiàn)（頜面骨腫大畸形、病變區(qū)域疼痛向周圍反射）、影像CT學(xué)及病理學(xué)確診，其中毛玻璃樣型16例、結(jié)節(jié)狀硬化型14例、囊樣型14例。患者病患處竇腔、竇管、竇孔閉塞、變形縮小，正常骨小梁結(jié)構(gòu)溶解消失，覆蓋以密度不均勻的無小梁結(jié)構(gòu)區(qū)，皮質(zhì)變薄。病變部位單一累及上頜骨3例、篩骨4例、下頜骨5例、蝶骨3例;混合累計(jì)29例;年齡16～56歲，平均（36.35±11.26）歲，病程4～13年，其中男20例，女24例，吸煙18例、飲酒15例，收縮壓104.35～138.16 mmHg，平均（122.74±19.85）mmHg，舒張壓60.32～89.42 mmHg，平均（68.74±14.91）mmHg，BMI 22.45～23.99 kg/m2，平均（23.54±2.36）kg/m2。44例頜面骨纖維異常增殖癥患者中高血壓7例、冠心病3例、高血脂3例，患者均無既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內(nèi)手術(shù)史、下肢外傷史、長期臥床史，簽署知情同意書。選擇同期我院口腔科外傷10例正常新鮮頜骨骨折碎片組織標(biāo)本作為陰性對(duì)照。兩組在性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①無精神障礙史，能夠進(jìn)行自由的溝通與交流;②具備生活自理的能力，在意識(shí)方面比較清醒;③各組患者需要對(duì)知情書進(jìn)行簽署，也可由他們的直系親屬代簽。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有較為嚴(yán)重的精神病史和心源性休克癥狀;②在本次治療期間，同時(shí)有其他放療;③患者心肝功能較弱，存在一些急性的炎癥，或者有血液病。

1.2 ELISA法測定TWSG1蛋白水平

此次實(shí)驗(yàn)所用的器具預(yù)先使用高壓進(jìn)行滅菌和烘干操作，嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)范。將保存在液氮罐中的病例組頜面骨纖維異常增殖組織及對(duì)照組頜骨骨折碎片組織取出解凍。準(zhǔn)確稱取0.2 g頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織，微波粉碎器速將其碾碎至粉末狀;將組織粉末轉(zhuǎn)入2 mL Eppendorf管中，加入1.5 mL PBS（pH7.4），充分振蕩混勻，2000 g，4℃，靜止1 h，然后離心20 min。仔細(xì)收集上清液。獲取頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織勻漿后， ELISA法（試劑盒購于南京金益柏生物科技有限公司）檢測頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中的TWSG1蛋白表達(dá)量。

1.3 TWSG1在頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中表達(dá)水平的測定

免疫組化方法測定TWSG在頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中的表達(dá)，對(duì)骨骼組織常規(guī)脫鈣，制作常規(guī)5 μm石蠟切片，3% H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%TWSG抗體工作液（購于英國Abcam公司），4℃過夜，加入二抗（IgG），室溫30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。TWSG1染色陽性為骨母細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿/核，以細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕色者為陽性，無黃染者為陰性。采用雙盲法統(tǒng)計(jì)結(jié)果，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時(shí)計(jì)數(shù);>50%為（+++），26%～50%為（++），6%～25%為（+），陽性細(xì)胞≤5%為（-），（-）及（+）歸為不表達(dá)組或低表達(dá)組，（++）及（+++）歸為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過Epidata、SPSS19.0導(dǎo)入相關(guān)的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TWSG蛋白以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行表示，并預(yù)先實(shí)施正態(tài)檢驗(yàn)，若正態(tài)性得到滿足，則使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，若正態(tài)性不能滿足，則在轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)之后，進(jìn)行單因素方差分析，然后使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較;TWSG蛋白的表達(dá)情況與頜面骨纖維異常增殖癥患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組TWSG1蛋白水平的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照組的TWSG1為（19.87±9.76）ng/g，病例組的TWSG1為（146.98±15.14）ng/g，病例組TWSG1蛋白水平表達(dá)水平高于對(duì)照組（t=25.281，P<0.01）。

2.2 兩組TWSG1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

由表2及封三圖2可見，對(duì)照組高倍視野的陽性細(xì)胞為10.0%，屬于（+）類，為低表達(dá)組;病例組高倍視野的陽性細(xì)胞為81.8%，屬于（+++）類，為高表達(dá)組。病例組TWSG1蛋白陽性率高于對(duì)照組（χ2=19.483，P<0.01）。

2.3 TWSG1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

由表3可見，TWSG1蛋白表達(dá)與性別、影像CT分類相關(guān)性不明顯（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;與年齡、病變部位相關(guān)性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型，TWSG1蛋白陽性表達(dá)率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）。

2.4 TWSG1蛋白表達(dá)與頜面骨纖維異常增殖癥患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

由表4可見，TWSG1蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，術(shù)后有復(fù)發(fā)，TWSG1蛋白陽性表達(dá)率越高（χ2=6.308，P<0.05）。

3 討論

TWSG1是與果蠅蛋白R(shí)UNT具有高度同源性的骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化以及骨基質(zhì)的礦化是必不可少的[9]。小鼠TWSG1的缺失可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙，而人類的RUNT基因發(fā)生突變，則可產(chǎn)生鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征，這是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其特征為鎖骨缺失、囟門開放、牙齒多生、身材矮小。TWSG1的分子結(jié)構(gòu)域包括3個(gè)部分：1、富含谷氨酰胺/丙氨酸的N-末端區(qū)（Q/A）;2、具有與果蠅RUNT蛋白高度同源性的中間RUNT區(qū)域;3、含有DNA結(jié)合區(qū)域以及富含脯氨酸/絲氨酸/蘇氨酸的C-末端區(qū)（P/S/T）[10-12]。（P/S/T）區(qū)域極其重要，因?yàn)門WSG1可通過這一區(qū)域激活成骨細(xì)胞相關(guān)基因，這些基因主要有骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein，BSP）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）等[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，病例組TWSG1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，病例組TWSG1蛋白陽性率高于對(duì)照組，這提示TWSG1在頜面骨纖維異常增殖癥中，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。TWSG1與成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)不一致，在時(shí)間關(guān)系上，TWSG1先于OCN的表達(dá)[15];而在前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，成骨細(xì)胞標(biāo)志物OCN、BSP、ALP都急劇增加，但是TWSG1卻沒有顯著變化。這些研究均暗示，TWSG1對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的調(diào)控密切相關(guān)。

此外，TWSG1對(duì)骨纖維細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展起到一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)：TWSG1能夠促進(jìn)骨纖維細(xì)胞朝一定方向轉(zhuǎn)移，并對(duì)淋巴、上皮、中性粒、內(nèi)皮等部位的細(xì)胞進(jìn)行激活[16]。TWSG1促進(jìn)了骨纖維細(xì)胞的增殖啟動(dòng)，抑制細(xì)胞的凋亡，它比野生株的增殖能力更高。TWSG1的骨纖維細(xì)胞還會(huì)粘附在細(xì)胞的外基質(zhì)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）有可能由TWSG1調(diào)控，高表達(dá)TWSG1蛋白的成骨細(xì)胞可促進(jìn)IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在促進(jìn)骨纖維異常增殖的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[18-20]。

本研究結(jié)果中，TWSG1蛋白表達(dá)與性別、影像CT分類相關(guān)性不明顯;與年齡、病變部位、術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型、術(shù)后有復(fù)發(fā)，則TWSG1蛋白陽性表達(dá)率越高，這提示 TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進(jìn)展預(yù)后密切相關(guān)，綜合TWSG1在骨瘤細(xì)胞患者的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨瘤細(xì)胞患者TWSG1蛋白表達(dá)異常增高，且隨著骨瘤細(xì)胞患者T分期的進(jìn)展，TWSG1蛋白表達(dá)逐漸增高，TWSG1能夠很好地調(diào)控骨瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展，具備了時(shí)間和空間的表達(dá)特異性，若藥物沉默TWSG1蛋白表達(dá)，則不能有效促進(jìn)骨瘤細(xì)胞的生長，說明TWSG1有可能作為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進(jìn)展預(yù)后密切相關(guān)，其機(jī)制與TWSG1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化有關(guān)，TWSG1可能成為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張文賢，周紅，錢濟(jì)先，等. 骨纖維異常增殖癥并發(fā)重度脊椎后凸畸形1例[J]. 中國骨傷，2016，29（10）：939-942.

[2] 房鳳嶺，任秀智，毛國良. 骨纖維異樣增殖癥骨痛的治療藥物研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2017，32（7）：1388-1392.

[3] Burke AB，Collins MT，Boyce AM. Fibrous dysplasia of bone： craniofacial and dental implications[J]. Oral Diseases，2017，23（6）：697-708.

[4] He H，Liu Q，Zhang C，et al. Comprehensive analysis of gene mutation and expression profiles in fibrous dysplasia of bone via next-generation sequencing[J]. Oncotarget，2018，2（2）：56-58.

[5] Corsi A，Ippolito E，Robey P G，et al. Bisphosphonate-induced zebra lines，in fibrous dysplasia of bone：histo-radiographic correlation in a case of McCune-Albright syndrome[J]. Skeletal Radiology，2017，46（10）：1435-1439.

[6] Yau B，Kua HW，Lo MF. Intramuscular myxoma and fibrous dysplasia of bone presents as Mazabraud's syndrome[J]. Anz Journal of Surgery，2017，5（5）：34-35.

[7] Xia S，Ji R，Xu Y，et al. Twisted Gastrulation BMP Signaling Modulator 1 Regulates Papillary Thyroid Cancer Cell Motility and Proliferation[J]. Journal of Cancer，2017， 8（14）：2816-2827.

[8] 劉玉潔. 慢性高原病大鼠模型Hepcidin、TWSG1表達(dá)水平的研究[D]. 青海大學(xué)，2016.

[9] 王羽， 王海濤， 王金霞，等. 一次急性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠肝TWSG1、BMP6、SMAD4mRNA及肝非血紅素鐵的時(shí)相性變化[J]. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（11）：997-1000.

[10] 顧樹程，宋曉麗，趙佑山，等. 骨髓增生異常綜合征患者骨髓鐵調(diào)素水平的研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，33（1）：56-61.

[11] Yi Y，Yang H，Xu X，et al. Expression and Significance of TWSG1 in Craniofacial Fibrous Dysplasia[J]. West Indian Medical Journal， 2016，4（4）：67-69.

[12] Tanno T，Porayette P，Sripichai O，et al. Identification of TWSG1 as a second novel erythroid regulator of hepcidin expression in murine and human cells[J]. Blood，2009，114（1）：181-183.

[13] Sun M，F(xiàn)orsman C，Sergi C，et al. The expression of twisted gastrulation in postnatal mouse brain and functional implications[J]. Neuroscience，2010，169（2）：920-931.

[14] 王真. TWSG1在顱頜面骨纖維異常增殖癥中的表達(dá)及意義[D]. 南昌大學(xué)，2014.

[15] 顧樹程，宋曉麗，趙佑山，等. 鐵過載的骨髓增生異常綜合征患者鐵調(diào)素水平及其相關(guān)因素的研究[C]. 中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議，2012.

[16] Kauvar EF，Hu P，Pineda-Alvarez DE，et al. Minimal evidence for a direct involvement of twisted gastrulation homolog 1（TWSG1）gene in human holoprosencephaly[J]. Molecular Genetics & Metabolism，2011，102（4）：470-472.

[17] Capp M，Heinze R，F(xiàn)orsman C，et al. Effect of TWSG1 and BMP7 on Mammary Cell Migration[C]. Aadr Meeting，2012，8（3）：34-37.

[18] 顧樹程. 骨髓增生異常綜合征鐵調(diào)素及其相關(guān)因素的研究和APAF-1基因與紅系凋亡在鐵過載中的研究[D].上海交通大學(xué)，2013.

[19] Brazil，Derek P Church，Rachel H Surae，et al. BMP signalling：Agony and antagony in the family[J]. Trends in Cell Biology，2015，36（5）：249-264.

[20] Fenwick MA，Mansour YT，F(xiàn)ranks S，et al. Identification and regulation of bone morphogenetic protein antagonists associated with preantral follicle development in the ovary[J]. Endocrinology，2011，47（9）：3515-3526.