循環(huán)游離DNA在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用進(jìn)展*

徐婧， 周有連， 徐豪明， 聶玉強(qiáng)

廣州市第一人民醫(yī)院、華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科(廣東廣州 510180)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)。研究顯示，CRC居我國(guó)癌癥發(fā)病率和病死率的前5位[1]。一直以來(lái)，CRC篩查工作以糞便潛血結(jié)合結(jié)直腸鏡為主，但面臨內(nèi)鏡診斷流程多、患者依從性差、社區(qū)宣教普及困難等缺點(diǎn)。因此，尋找一種能夠?qū)RC進(jìn)行早期診斷和預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)記物刻不容緩[2-3]。循環(huán)游離DNA (circulating cell-free DNA，cfDNA) 是1948年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外碎片DNA[4-5]，主要來(lái)自細(xì)胞壞死、凋亡。腫瘤細(xì)胞釋放的cfDNA通常稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA/cell-free tumor DNA，ctDNA)，其中一些能反映腫瘤的特異性特征，包括體細(xì)胞突變和異常的DNA甲基化模式，被認(rèn)為是極具臨床運(yùn)用前景的腫瘤標(biāo)記物[6-9]。與組織活檢比，檢測(cè)ctDNA有許多方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)檢測(cè)方法相對(duì)微創(chuàng)；(2)ctDNA能很好地代表患者腫瘤的特征，有很高的特異性；(3)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA定量和定性變化，可實(shí)時(shí)對(duì)患者的疾病復(fù)發(fā)和治療療效進(jìn)行判斷；(4)檢測(cè)ctDNA能全面地了解腫瘤的遺傳學(xué)信息，避免組織活檢因腫瘤的異質(zhì)性而漏掉腫瘤部分生物學(xué)特征，從而更好地對(duì)患者的個(gè)體化治療提供選擇。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外關(guān)于cfDNA的最新研究，對(duì)目前檢測(cè)cfDNA的方法和cfDNA在CRC中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 cfDNA檢測(cè)方法

腫瘤細(xì)胞釋放的cfDNA占外周血總cfDNA很小一部分，所以需要高敏感性的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。常用的檢測(cè)方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和二代測(cè)序(NGS)包括全基因組測(cè)序和全外顯子組測(cè)序等?；趯?shí)時(shí)PCR的檢測(cè)方法廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)低線(LoD)為0.1%～0.5%的cfDNA測(cè)量，但當(dāng)cfDNA用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)早期疾病時(shí)，ctDNA的比例往往低至0.01%。最近發(fā)展出許多基于PCR改進(jìn)的檢測(cè)方法，包括基于等位基因定量PCR的Intplex技術(shù)，其敏感性范圍為0.004%～0.014%，以及乳液PCR技術(shù)如微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、BEAMing數(shù)字PCR等，其敏感性范圍為0.001%～0.01%[7, 10-11]。PCR可對(duì)cfDNA中的遺傳學(xué)改變有較好的檢測(cè)，但存在每次只能分析少量位點(diǎn)的問(wèn)題。而運(yùn)用NGS可以在一次測(cè)序中同時(shí)對(duì)全基因組的遺傳學(xué)改變進(jìn)行測(cè)量[12]，能顯著提高早期CRC患者cfDNA中體細(xì)胞突變的鑒定，但全基因組和全外顯子組測(cè)序的缺點(diǎn)是對(duì)于cfDNA的檢測(cè)分析敏感性很低。新近出現(xiàn)的靶向測(cè)序方法，將分子條碼和適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)篩選步驟與DNA片段的深度測(cè)序結(jié)合起來(lái)，從而對(duì)其敏感性有所改進(jìn)[13-15]。除此之外，還有亞硫酸鹽測(cè)序法、特異性化學(xué)標(biāo)記法(hmC-Seal)等檢測(cè)cfDNA中的表觀遺傳學(xué)特點(diǎn)，為cfDNA的檢測(cè)賦予了更深層次的意義[16]。

2 cfDNA在CRC診療中的應(yīng)用

2.1 cfDNA與CRC的診斷 cfDNA檢測(cè)有微創(chuàng)性優(yōu)點(diǎn)，使得這一方法可能成為腫瘤早期篩查的新手段。大量研究表明，cfDNA水平的增高可能提示腫瘤的發(fā)生[17-19]，不過(guò)cfDNA不僅來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，也來(lái)自正常細(xì)胞的壞死和凋亡，故在循環(huán)中含量很低，易受多種因素影響。特別是當(dāng)處于早期疾病時(shí)cfDNA的含量更低，所以利用cfDNA水平進(jìn)行CRC篩查的敏感度和特異度都較低。Kopreski等[20]在8例CRC患者中成功檢測(cè)到其中5個(gè)KRAS突變的存在，但也在170個(gè)正常的沒(méi)有腫瘤表現(xiàn)的個(gè)體中檢測(cè)到37個(gè)有KRAS突變變化。與腫瘤相關(guān)的基因突變?cè)谏俨糠终€(gè)體中也能被檢測(cè)到，有些研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自健康個(gè)體的樣本中有0.45%～20%的cfDNA存在基因突變，尤其是TP53和KRAS突變[14, 21-23]，但結(jié)合甲基化水平能夠提升cfDNA的敏感度和特異度。

甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種改變形式，在2004年，Belinsky[24]指出超甲基化可能是癌癥發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵因素。血漿cfDNA甲基化特征的檢測(cè)相比cfDNA的定量和腫瘤特異基因突變水平，對(duì)腫瘤的早期診斷有更高的特異性。Liu等[25]對(duì)68例終止治療的常見(jiàn)晚期癌癥患者血漿cfDNA中9 223個(gè)持續(xù)超甲基化CpG位點(diǎn)進(jìn)行了全面的靶向甲基化測(cè)序，并以此進(jìn)行甲基化評(píng)分，成功檢測(cè)出57例患者癌癥的存在且準(zhǔn)確分辨出45個(gè)的潛在腫瘤類型，其中，甲基化評(píng)分對(duì)于CRC探測(cè)和分類的準(zhǔn)確度最高，分別為96.3%、88.5%。

甲基化模式于腫瘤病理的早期出現(xiàn)，而且在CRC腫瘤中表現(xiàn)突出，這些特點(diǎn)都使得它對(duì)CRC的篩查有著重要的意義[26]。血漿中的循環(huán)SEPT9 DNA是目前對(duì)于診斷CRC的一種研究較多的甲基化標(biāo)記物。Church等[27]進(jìn)行了一個(gè)大型的前瞻性研究，評(píng)估循環(huán)甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測(cè)CRC的準(zhǔn)確性。他們納入了7 900例計(jì)劃做內(nèi)窺鏡的參與者，發(fā)現(xiàn)其中53例CRC患者，循環(huán)甲基化SEPT9 DNA在篩查人群中檢測(cè)CRC的敏感度和特異度分別為48.2%、91.5%，檢測(cè)晚期腺瘤的敏感度為11.2%。上述結(jié)果顯示，血漿中的循環(huán)SEPT9 DNA是CRC的潛在腫瘤標(biāo)記物。類似基于甲基化cfDNA的研究眾多：如IKZF1/BCAT1、NPY/WIF-1、ALX4、APC、SFRP2、SDC2等[26]。結(jié)合多個(gè)甲基化生物標(biāo)記物能提高cfDNA對(duì)CRC的早期診斷能力，但這仍需要更多的臨床研究證明和敏感度更高的檢測(cè)技術(shù)支持[28]。

此外， DNA的羥甲基化也是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。5-羥甲基胞嘧啶不僅是主動(dòng)去甲基化過(guò)程中的中間媒介，而且作為一個(gè)穩(wěn)定的DNA標(biāo)記，在腫瘤的早期診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRC患者和健康對(duì)照者血漿中5hmC的差異信號(hào)，能很好地分辨出CRC患者，利于CRC的早期診斷[16]?？偟膩?lái)說(shuō)，通過(guò)追蹤cfDNA中的表觀遺傳修飾特點(diǎn)，我們可以進(jìn)一步追溯該異常cfDNA的來(lái)源組織，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于CRC及其轉(zhuǎn)移的早期診斷。

2.2 cfDNA與CRC的療效評(píng)價(jià) 腫瘤的異質(zhì)性一直是腫瘤治療研究難以攻克的大難關(guān)，使得很多抗癌治療無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果。cfDNA的動(dòng)態(tài)變化為腫瘤異質(zhì)性和腫瘤進(jìn)展評(píng)估提供了更便捷的方法，并且在時(shí)間上比常用的影像學(xué)方法能更早地判斷治療效果。de Figueiredo Barros等[29]分別檢測(cè)了組織樣本(原發(fā)和轉(zhuǎn)移性)和血漿樣本中5個(gè)腫瘤相關(guān)基因突變，血漿樣本檢測(cè)到的突變種類明顯多于組織樣本。同時(shí)，血漿樣本中ctDNA突變頻率也隨著化療進(jìn)行而變化。在治療期間，計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)對(duì)于疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)明顯晚于ctDNA。在Janku等[30]的研究中，通過(guò)相關(guān)性分析，表明經(jīng)歷全身治療患者中cfDNA VAF的變化與對(duì)放療反應(yīng)呈正相關(guān)。

cfDNA中的異常甲基化模式也可用來(lái)評(píng)估CRC患者的治療療效。Bhangu等[31]的研究納入34例肝切除術(shù)前接受新輔助化療治療的CRC肝轉(zhuǎn)移患者，并收集患者基線及每次新輔助化療周期前外周血血漿，分析48個(gè)CRC相關(guān)基因的異常甲基化。他們發(fā)現(xiàn)甲基化標(biāo)志物水平與腫瘤基線體積和治療反應(yīng)相關(guān), 且具有較高的敏感度和特異度，通過(guò)對(duì)CRC相關(guān)性甲基化標(biāo)記物的連續(xù)測(cè)量，可能對(duì)于接受新輔助化療的CRC肝轉(zhuǎn)移患者的早期療效評(píng)估有一定價(jià)值。

2.3 cfDNA與CRC的預(yù)后 在cfDNA中，部分腫瘤特異性變異與腫瘤預(yù)后有很好的相關(guān)性，如KRAS、BRAF等，常被用來(lái)檢測(cè)癌癥患者的預(yù)后。Perets等[32]用二代測(cè)序技術(shù)(NGS)對(duì)17例轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管癌患者血漿ctDNA進(jìn)行KRAS突變分析，發(fā)現(xiàn)5/17(29.4%)患者血漿KRAS突變，且KRAS突變與更短的生存期相關(guān)；Janku等[30]在一項(xiàng)針對(duì)55例晚期癌癥患者的研究中，用超深下代測(cè)序(ultradeep NGS) 對(duì) 61個(gè)癌癥相關(guān)基進(jìn)行突變分析，發(fā)現(xiàn) cfDNA變異等位基因頻率(VAF)高的患者，比VAF更低者存活時(shí)間更久。通過(guò)治療前后cfDNA中腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，我們可以監(jiān)測(cè)腫瘤的進(jìn)展可能，預(yù)測(cè)患者的無(wú)腫瘤生存期和選擇針對(duì)性更強(qiáng)的靶向藥物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。最近抗腫瘤二、三線治療的研究數(shù)據(jù)表明，檢測(cè)到cfDNA中KRAS突變的CRC患者對(duì)于抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)靶向藥物治療的療效很差[33-35]。Wong等[36]的實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)，他們研究顯示，在瑞戈非尼治療期間，能在血漿中檢測(cè)到KRAS突變的CRC患者相比檢測(cè)不到KRAS突變患者，前者PFS更短。

cfDNA中的耐藥突變也可作為監(jiān)測(cè)CRC發(fā)展的良好指標(biāo)之一。有一個(gè)研究觀察到KRAS突變克隆隨治療而波動(dòng)，在進(jìn)展時(shí)KRAS等位基因的改變相對(duì)增加，而在EGFR阻滯劑停藥后則下降[37]。Bettegowda等[38]對(duì)比24例正進(jìn)行抗EGFR治療的轉(zhuǎn)移性CRC患者實(shí)體瘤樣本，發(fā)現(xiàn)其血漿ctDNA中的耐藥突變也能檢測(cè)抗EGFR耐藥性。他們不僅檢測(cè)到了KRAS 基因突變，還檢測(cè)到了在疾病進(jìn)展時(shí)的KRAS擴(kuò)增[39]，而這些基因變化都可以通過(guò)對(duì)cfDNA的檢測(cè)而探測(cè)到。利用這些cfDNA改變，我們可以動(dòng)態(tài)地觀察腫瘤進(jìn)化，據(jù)此調(diào)整抗癌方案，使得患者有更好的療效和更少的毒性不良反應(yīng)。

除cfDNA中的腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，cfDNA的總量也被認(rèn)為是CRC預(yù)后判斷和發(fā)展監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。Bettegowda等[38]的研究首次發(fā)現(xiàn)KRAS突變片段的水平和CRC患者更短的總生存時(shí)間相關(guān)。Bedin等[19]納入了114例CRC患者，與65例健康受試者和22例腺瘤病灶患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估研究，結(jié)果顯示cfDNA水平升高與預(yù)后不良密切相關(guān)；一項(xiàng)對(duì)2003—2014年發(fā)表的包括1 022例CRC患者9項(xiàng)研究的Meta分析表明，cfDNA的定量檢測(cè)可預(yù)測(cè)無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間(RFS)和總生存時(shí)間(OS)[40]。但由于不同檢測(cè)cfDNA技術(shù)的敏感度和特異度的不同，導(dǎo)致檢測(cè)出的cfDNA水平也有差異，從而造成對(duì)疾病預(yù)后的估計(jì)有所偏差。最近一個(gè)研究將18F-FDG PET/CT所測(cè)得的全身基線代謝活性腫瘤體積與cfDNA基線水平結(jié)合起來(lái)，對(duì)轉(zhuǎn)移性CRC患者的預(yù)后也有很好的預(yù)測(cè)作用[41]。

3 展望

通過(guò)對(duì)cfDNA的定量、特異性基因突變和甲基化形式的檢測(cè)，我們可以將其運(yùn)用于對(duì)CRC早期疾病和治療性手術(shù)后微小殘留灶的檢測(cè)、復(fù)發(fā)評(píng)估、治療療效和化療耐藥的評(píng)價(jià)，而這些在目前的研究中已經(jīng)取得了很多進(jìn)展。不過(guò)，將cfDNA的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍有一定障礙。目前對(duì)于cfDNA的檢測(cè)技術(shù)并沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化，這使得各個(gè)研究所測(cè)的cfDNA結(jié)果存在較大差異。我們已經(jīng)知道cfDNA來(lái)源于細(xì)胞壞死、凋亡以及少部分細(xì)胞的主動(dòng)釋放，但對(duì)于cfDNA的來(lái)源和生理特征我們理解得并不深入，這些知識(shí)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也是相輔相成的。此外，將cfDNA的檢測(cè)用于臨床還需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的分析前程序，包括血漿的收集、獲取和儲(chǔ)存、cfDNA的抽取等。cfDNA由于自身性質(zhì)和腫瘤異質(zhì)性，利用其水平對(duì)腫瘤的檢測(cè)敏感度和特異度并不高，需要發(fā)展更靈敏和特異的檢測(cè)技術(shù)和更具特異性的cfDNA特征作為標(biāo)記物。此外，cfDNA在體內(nèi)含量低，也存在于健康個(gè)體中，不同時(shí)期的結(jié)直腸癌患者cfDNA檢測(cè)時(shí)間是變化的[42]，這些都為cfDNA的臨床價(jià)值帶來(lái)影響。

總的來(lái)說(shuō)，未來(lái)仍需要大樣本量、前瞻性、多中心隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證cfDNA在CRC診療中的作用，并結(jié)合多種cfDNA標(biāo)記物，提高檢測(cè)的敏感性和特異性。除此之外，我們還應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)cfDNA的基礎(chǔ)和技術(shù)研究，以及早日達(dá)到檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。隨著對(duì)cfDNA檢測(cè)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的更多努力，相信CRC的檢測(cè)和治療監(jiān)測(cè)思路會(huì)日益豐富，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療和患者利益的提高，為更多的腫瘤患者帶來(lái)福音。