A2 奶的研究進(jìn)展及其上游奶源的篩選培養(yǎng)

吳宇銀，劉安琪，李慶雷，陳志偉,4

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.山東理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，山東 淄博 255000；3.山東高速生物工程有限公司，濟(jì)南 250100；4.山東理工大學(xué)食品與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)研究院，山東 淄博 255000）

0 引 言

牛乳蛋白質(zhì)主要有酪蛋白和乳清蛋白兩大類，酪蛋白由α-、β-、κ-和γ-組成，其中β-酪蛋白約占總蛋白的40%[1]，其顯著特點(diǎn)是幫助嬰幼兒成長(zhǎng)發(fā)育和提高對(duì)礦物質(zhì)的吸收。β-酪蛋白主要存在2 種基因變異體，A1 基因型和A2 基因型，與之相對(duì)應(yīng)的是A1 牛奶和A2 牛奶[2]。A1 和A2 型β-酪蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異，正是這種差異使A2 型β-酪蛋白比A1 型更接近天然母乳中的蛋白質(zhì)，成為牛奶蛋白成分研究的熱點(diǎn)。

2016 年，首次在臨床研究中證明了人類飲用含A2 的A1 奶和只飲用A2 奶的影響差異[3]。從此國(guó)內(nèi)乳品行業(yè)開始逐鹿A2 乳品領(lǐng)域，直至目前A2 奶已成為國(guó)內(nèi)各乳品企業(yè)研發(fā)的新方向，也已打破了新西蘭A2 牛奶公司對(duì)國(guó)內(nèi)A2 奶粉配方的科技?jí)艛郲4]。A2 奶開發(fā)的進(jìn)展，也促進(jìn)了A2 奶牛畜牧領(lǐng)域的變革。本文介紹了A2 奶的特性及優(yōu)點(diǎn)、檢測(cè)方法，關(guān)注人類健康，簡(jiǎn)述上游奶源的研究趨勢(shì)，對(duì)A2 奶在乳品行業(yè)引領(lǐng)潮流的原因進(jìn)行多方面分析，為了解A2 奶發(fā)展情況提供參考。

1 A2 奶的研究進(jìn)展

1.1 A1 與A2 型β-酪蛋白的差異性

最初，自然界中并沒有A1 型β-酪蛋白的存在，它是由A2 型β-酪蛋白基因突變產(chǎn)生的，在后續(xù)的自然迭代和養(yǎng)殖中沒有進(jìn)行指向性的篩選，導(dǎo)致A1 型β-酪蛋白成為主導(dǎo)，因此A2 基因型被看作原始β-酪蛋白基因型[5]。從純營(yíng)養(yǎng)的角度來看，普通牛奶在蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)方面與A2牛奶相似[6]。A1 型和A2 型β-酪蛋白之間的唯一區(qū)別是位置67 處的氨基酸類型，其中A1 型在該位置上結(jié)合組氨酸，A2 型結(jié)合脯氨酸[7]。由于氨基酸的差異，A1型β-酪蛋白在消化和吸收后，將產(chǎn)生由7 個(gè)氨基酸組成的肽段，即β-酪啡肽-7（β-casomorphin-7，簡(jiǎn)稱BCM-7）；A2 型β-酪蛋白在消化后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)由9個(gè)氨基酸形成的肽段β-酪啡肽-9（β-casomorphin-9，簡(jiǎn)稱BCM-9）[8]。

A1 和A2 型β-酪蛋白在結(jié)構(gòu)上存在氨基酸的差異，且有研究表明，飲用A1 型牛奶會(huì)提高冠心病的發(fā)病率并降低身體的免疫功能，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化和I 型糖尿病[9-10]，飲用A2型牛奶可減少胃腸道炎癥反應(yīng)[11]。而A2 型β-酪蛋白具有改善嬰兒的消化功能的潛力，能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]。表明A2 奶與普通A1 奶相比，對(duì)人體的消化負(fù)擔(dān)更小，滿足多種人群乳品營(yíng)養(yǎng)需要。

1.2 普通牛奶中的不利影響因子

BCM-7 全稱為阿片肽β-酪啡肽-7，其序列特征為H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-OH，分子式：C41H55N7O9，分子質(zhì)量為789.9 g/mol，它可以潛在地影響神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)中的許多阿片類受體[13]。研究表明，含有A1 型β-酪蛋白的普通牛奶在消化過程中產(chǎn)生的BCM-7 能夠被人體直接吸收。BCM-7 是一種外啡肽，具有很高的阿片活性，與μ-型阿片受體有良好的親和力[14]。研究發(fā)現(xiàn)，BCM-7 物質(zhì)的出現(xiàn)會(huì)影響胃腸消化運(yùn)轉(zhuǎn)和髓過氧化物酶活性，從而導(dǎo)致人體不適[15]?；谀壳暗难芯拷Y(jié)果，已經(jīng)有很多國(guó)家的廠商開始對(duì)奶牛種群進(jìn)行篩選并制造A2 型牛奶及其奶制品，為消費(fèi)者提供更加適合自身體質(zhì)消化的食品選擇。

1.3 A2 奶中β-酪蛋白檢測(cè)方法

掌握A1、A2 型牛奶的區(qū)分方法可以更深刻的了解2 種牛奶本質(zhì)結(jié)構(gòu)上的不同，以及其檢測(cè)作用位點(diǎn)的差異。針對(duì)人體腸胃消化吸收能力的不同，幫助人們選擇更加適合自身腸胃消化的牛奶，對(duì)促進(jìn)人體營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)發(fā)育有很大的幫助。

目前，在蛋白質(zhì)層面上，常見的β-酪蛋白分型檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫試劑盒法、液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、中紅外光譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)等[16-19]。在基因?qū)用嫔?，借由生物分析技術(shù)檢測(cè)β-酪蛋白分型的方法有LNA 探針法和Rh Amp 檢測(cè)法等[20-21]。這些方法均有一定適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，如表1 所示，而基因?qū)用媾c蛋白質(zhì)層面的檢測(cè)相比，具有高通量、快速準(zhǔn)確、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，可提高β-酪蛋白分型效率，也可以應(yīng)用于牛群的基因分型。

表1 β-酪蛋白的檢測(cè)方法

1.4 A2 奶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

從物理化學(xué)角度來看，與A1 型β-酪蛋白相比，A2 型β-酪蛋白的疏水性較低，形成的膠束較小[22]。有報(bào)道稱，A2 型β-酪蛋白使牛奶具有較差的凝乳酶凝固特性[23]。NGUYEN H T H 等[24]報(bào)告稱，與A1 牛奶制成的凝膠相比，A2 牛奶制成的酸性牛奶凝膠具有更低的彈性模量，更高的孔隙率和更薄的蛋白質(zhì)鏈。

酪蛋白酸鈉是牛奶中主要蛋白質(zhì)酪蛋白的鈉鹽，是一種安全無害的增稠劑和乳化劑，被廣泛使用在乳制品中。此外，它含有人體所需的全部必需氨基酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能夠作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑食用。YACINE H 等[25]利用小角度X 射線散射探測(cè)了分別從A2 和A1A2 奶（普通牛奶）中獲得的酪蛋白酸鈉粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及界面性質(zhì)，結(jié)果表明酪蛋白酸鈉的黏度會(huì)隨著酪蛋白酸鈉濃度的增加而增加。從A2 和A1A2 奶中獲得的酪蛋白酸鈉的結(jié)構(gòu)和界面性質(zhì)并無明顯差異，這可能是雖然A1 和A2 型β-酪蛋白有差異，但酪蛋白酸鈉的數(shù)量差異可能不足夠大到改變酪蛋白酸鈉的行為差異。

NGUYEN H T H 等[24]研究了β-酪蛋白A2 變體與A1 變體對(duì)牛奶鈣分布、酸性凝膠和發(fā)泡特性以及酸性乳凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響。研究表明，含β-酪蛋白表型A2A2 的牛奶具有較高比例的游離離子鈣，增強(qiáng)了泡沫的形成能力，需要更長(zhǎng)的凝膠化時(shí)間。與A1A1 奶相比，A2A2 奶凝膠在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的儲(chǔ)存模量顯著降低。與A1A1 乳凝膠相比，A2A2 乳凝膠中具有更多孔的微觀結(jié)構(gòu)和更薄的蛋白質(zhì)鏈導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度更低。這可能支持乳制品生產(chǎn)商開發(fā)具有不同功能特性的新型乳制品。

此外，現(xiàn)階段乳品企業(yè)對(duì)嬰幼兒A2 奶粉配方的研究較多，其中A2 牛奶公司更是A2 奶的領(lǐng)軍“人物”。之后，快速發(fā)展的A2 乳品領(lǐng)域無疑成為了許多乳品企業(yè)的選擇，而隨著實(shí)力雄厚的乳品企業(yè)的不斷涌入，反過來又使A2 奶市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，吸引了越來越多的關(guān)注。這不僅推動(dòng)了有關(guān)A2 奶物理結(jié)構(gòu)特性的研究，也推動(dòng)了A2 奶作用于動(dòng)物體影響其生理指標(biāo)的科學(xué)研究，為A2 奶的營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)制提供更完善、更明確的理論支撐。

1.5 A2 奶的優(yōu)點(diǎn)及其市場(chǎng)發(fā)展

普通牛奶中的β-酪蛋白以A1 型酪蛋白為主，若牛奶中的β-酪蛋白全是A2 型，則該牛奶就是所謂的“A2 奶”。中國(guó)人飲用牛奶后出現(xiàn)胃腸道失調(diào)的癥狀約占90 %。亞洲人出現(xiàn)乳糖不耐受的癥狀是較為普遍的，表現(xiàn)為飲用牛奶后會(huì)引起不同程度的腹脹、腹痛、腹瀉等胃腸不適[3]。后來有研究表明，A2 奶更近似于母乳，易于被人體吸收，可以緩解乳糖不耐受癥狀，改善腹脹、腸道噪音和消化舒適等。

隨著乳品行業(yè)的發(fā)展，A2 型β-酪蛋白乳制品將成為乳制品消費(fèi)的新熱點(diǎn)，這使得A2 型β-酪蛋白乳制品也轉(zhuǎn)變?yōu)槿槠菲髽I(yè)的“戰(zhàn)場(chǎng)”，成為國(guó)內(nèi)外乳品企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)更為激烈的項(xiàng)目[8]。繼A2 公司之后，惠氏（Wyeth）、達(dá)能（Danone）、君樂寶（Junlebao）、飛鶴（Feihe）、伊利（Yili）、雅培（Abbott）、新希望（New Hope）等知名乳企也推出了新的A2 蛋白奶粉產(chǎn)品。除此之外，下游乳品企業(yè)的需求增長(zhǎng)推動(dòng)了上游A2 型奶牛畜牧業(yè)在A2 奶源領(lǐng)域的發(fā)展布局[4]。推動(dòng)了A2 奶源建設(shè)牧場(chǎng)，且更多新建牧場(chǎng)在規(guī)劃時(shí)就考慮到A2 基因奶牛的篩選和育種。

2 A2 奶與人體健康

2.1 A2 奶可降低Ⅰ型糖尿病發(fā)病率

Ⅰ型糖尿病，舊稱青少年糖尿病或胰島素依賴型糖尿病，是一種代謝紊亂綜合征，主要是由于通過免疫介導(dǎo)胰腺β細(xì)胞的破壞造成的[26]。在針對(duì)不同年齡段飲用牛奶人群的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒對(duì)于牛奶的依賴要遠(yuǎn)高于成年人，且他們的腸道中更易吸收BCM-7[27]，使部分研究聚焦于牛奶與Ⅰ型糖尿病之間的相關(guān)性。研究人員針對(duì)不同國(guó)家和地區(qū)牛奶的發(fā)病率和消費(fèi)量進(jìn)行調(diào)查，嘗試確定牛奶是否會(huì)誘發(fā)Ⅰ型糖尿病，在這些研究中，有認(rèn)為A1 奶更易引發(fā)Ⅰ型糖尿病的結(jié)論[28-30]，但也存在一些相反的結(jié)論[31-32]。ELLIOTT R B 等[33]在相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以A2奶飼養(yǎng)的小鼠，其I 型糖尿病的發(fā)病率低于用A1 奶飼養(yǎng)的小鼠。ELLIOTT R B 等[34]的其他研究表明，A2型β-酪蛋白可改善Ⅰ型糖尿病發(fā)病率，但關(guān)于其在人體內(nèi)作用的臨床研究尚未開展，暫時(shí)不能證明A2奶消化吸收后的產(chǎn)物與Ⅰ型糖尿病存在直接相關(guān)性。

2.2 A2 奶有助于調(diào)節(jié)情緒

乳汁是哺乳動(dòng)物早期生命中營(yíng)養(yǎng)的主要來源，戒掉乳汁和引入固體食物的過程，被稱為斷奶過程。AYA O 等[35]研究表明，斷奶可能通過調(diào)節(jié)發(fā)育中的腸-腦軸來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，導(dǎo)致動(dòng)物情緒發(fā)生變化。經(jīng)過LUTZ P E 等[36]的研究，對(duì)斷奶年齡的大鼠進(jìn)行了高親和力μ-阿片受體[37]（μ-opioid receptors，MOPrs）和催產(chǎn)素受體[38]（Oxytocin receptors，OTrs）的定量放射自顯影結(jié)合，選擇這些受體是因?yàn)槠鋵?duì)斷奶引起的變化很敏感，并參與了情緒調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明A1 奶顯著增加了大鼠的應(yīng)激誘導(dǎo)靜止，使得MOPrs 和OTrs 的腦區(qū)域特異性改變，以及尿生化檔案的改變。此外，尿腸道微生物代謝物與大腦代謝物的改變密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在斷奶后飲用含有A1 型β-酪蛋白的牛奶可能通過一種可能的腸-腦軸機(jī)制影響情緒[35]，而在斷奶后飲用A2 奶則不會(huì)對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)靜止行為產(chǎn)生負(fù)面影響，也不會(huì)誘導(dǎo)MOPrs 密度的腦特異性變化，且可以有效調(diào)節(jié)斷奶后大鼠的情緒。

一項(xiàng)自閉癥兒童的研究結(jié)果表明，自閉癥兒童尿液中BCM-7 的含量遠(yuǎn)高于正常兒童，且BCM-7 的濃度與患病情況的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[39]。但目前還未有與人相關(guān)的臨床研究來證明A2 奶可調(diào)節(jié)情緒。

2.3 A2 奶可改善肺部炎癥

牛奶的主要消化過程主要在胃腸道中進(jìn)行，因此多數(shù)研究集中在A1、A2 型β-酪蛋白的消化影響[40]。SUN 等[2]的一項(xiàng)研究表明，飲用A1 型β-酪蛋白的牛奶會(huì)惡化胃腸道癥狀。在小鼠模型中，喂食來自A1A1和A1A2 奶牛的β-酪蛋白增加了Th-2 驅(qū)動(dòng)的腸道炎癥[9,41]。但SHIKHA Y 等[42]的研究探討了牛奶中A1和A2 型β-酪蛋白變異作為導(dǎo)致小鼠模型過敏性氣道疾病的因素。A1A1 奶喂養(yǎng)小鼠支氣管肺泡灌洗液和血清中IL-4 和IL-5 水平顯著升高，IgE 和IgG 水平也顯著升高。同時(shí)，淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的擴(kuò)張?jiān)黾樱瑢?dǎo)致支氣管周圍炎癥。A1A2 奶粉喂養(yǎng)小鼠的表型為中間型，而A2A2 奶喂養(yǎng)小鼠的表型與對(duì)照組匹配，即未呈現(xiàn)炎癥。從相關(guān)研究中可表明，A1 奶對(duì)肺有促炎癥缺陷，導(dǎo)致表型與典型的過敏性哮喘表型密切匹配，但A2 奶不會(huì)出現(xiàn)此類癥狀?？上У氖沁€未有臨床研究證明A1 奶會(huì)直接引發(fā)人體肺部炎癥，而A2 奶不會(huì)出現(xiàn)此狀況。

3 A2 型奶牛的培養(yǎng)及篩選

3.1 A2 型奶牛養(yǎng)殖現(xiàn)狀

目前，許多海外乳品企業(yè)已開始生產(chǎn)和銷售A2 乳制品，且A2 型β-酪蛋白畜群已成為主要的奶源[43]，但國(guó)外尚無關(guān)于A2 型畜群生產(chǎn)和養(yǎng)殖的研究報(bào)告。

國(guó)內(nèi)奶牛的基因篩查工作已經(jīng)開始，大規(guī)模的育種和養(yǎng)殖工作也已逐步推進(jìn)。其中，山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司已對(duì)A2 型β-酪蛋白荷斯坦種公牛進(jìn)行定向培育工作，建立了種母牛群和種公牛群A2 型β-酪蛋白基因型鑒定方法，篩選獲得A2 型β-酪蛋白奶牛種群，結(jié)合奶牛群體改良（Dairy Herd Improvement，DHI）測(cè)定、計(jì)劃選配、靶向培育出具有高產(chǎn)A2型β-酪蛋白遺傳基礎(chǔ)的種公牛[44]。有很多牧場(chǎng)根據(jù)β-酪蛋白多態(tài)性來選擇牛群，為了在牛群中選育出純合A2A2 型個(gè)體，研究人員可采用各種不同的方法，如PCR-SSCP 法[45]、KASP 法、Taq Man 法等。對(duì)奶牛的分類培育養(yǎng)殖，有利于乳企通過加工工藝制作出不同風(fēng)味且易消化吸收的A2 型乳制品，全面滿足不同體質(zhì)人群對(duì)牛乳營(yíng)養(yǎng)的需求。

3.2 A2 型奶牛基因分型方法

3.2.1 單鏈構(gòu)象多態(tài)性法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products, PCR-SSCP）是一種基于DNA 構(gòu)象差異檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。如果相同長(zhǎng)度的單鏈DNA 的堿基序列不同，則形成的構(gòu)象就會(huì)不同，從而形成單鏈構(gòu)象多態(tài)性。

單鏈DNA 片段呈現(xiàn)復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這主要是通過分子內(nèi)相互作用（如堿基配對(duì)）來維持的。當(dāng)某一堿基改變時(shí)，其空間構(gòu)象會(huì)受到不同程度的影響，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化。在聚丙烯酰胺凝膠中具有不同空間構(gòu)象的單鏈DNA 分子的抗性是不同的。在已知基因型（A1A2、A2A2）的參考樣品中，PCR 產(chǎn)物為234 bp的17 %聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=100∶1）凝膠上同時(shí)檢測(cè)所有變體的效果最好[46]。這些結(jié)果通過對(duì)直接從聚丙烯酰胺凝膠中切下的等位基因特異性SSCP 條帶進(jìn)行測(cè)序得到證實(shí)。因此，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）可能對(duì)具有不同構(gòu)象的分子非常敏感，進(jìn)而非常靈敏地將其分離出來。

3.2.2 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）法

引物混合物是由2 個(gè)正向引物和1 個(gè)反向引物組成的，2 個(gè)引物具有2 個(gè)公共標(biāo)簽和鏈接的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)。進(jìn)行第1 輪PCR 擴(kuò)增，將DNA 模板與引物混合物中的相應(yīng)引物結(jié)合，擴(kuò)增完成SNP 鑒定。然后進(jìn)行第2輪PCR 擴(kuò)增，以擴(kuò)增等位基因末端的特異性標(biāo)記序列。最后進(jìn)行第3 輪PCR 擴(kuò)增，隨著PCR 擴(kuò)增，與特異性序列對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，檢測(cè)到相應(yīng)的信號(hào)。根據(jù)2 種不同的熒光基團(tuán)和聚類效應(yīng)，確定SNP 分型[47]。

3.2.3 Taq Man 法

Taq Man 法的基本原理是在PCR 擴(kuò)增過程中添加一對(duì)引物和一個(gè)特定的熒光探針，熒光探針的5'端與報(bào)告基團(tuán)連接，3' 端與淬滅基團(tuán)連接[43]。探針完成后，發(fā)射熒光信號(hào)的報(bào)告基團(tuán)被淬滅基團(tuán)吸收，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，5'-3' 定義的Taq 酶的酶活性可以切斷探針酶的降解，使報(bào)告基團(tuán)與熒光猝滅反應(yīng)分離，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能夠接收到熒光信號(hào)，即對(duì)于每條AMPL DNA 鏈，都能想成一個(gè)熒光分子，熒光信號(hào)的積累與PCR 的擴(kuò)增形成同步產(chǎn)品，這樣就可以達(dá)到突變檢測(cè)的目的。新的Taq Man MGB 探針可實(shí)現(xiàn)定量遺傳分析和SNP 分析，具有區(qū)分A1 或A2 型個(gè)體的高靈敏度。

4 總結(jié)與展望

目前，國(guó)內(nèi)A2 奶研發(fā)仍處于初步階段，但經(jīng)過國(guó)內(nèi)各乳品企業(yè)對(duì)A2 奶的創(chuàng)新發(fā)展，已經(jīng)推動(dòng)其上游奶源布局發(fā)生變動(dòng)。為促進(jìn)國(guó)內(nèi)A2 乳業(yè)更好、更健康、更長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)乳品企業(yè)仍需通過提升研發(fā)及檢測(cè)水平、提高產(chǎn)品質(zhì)量、豐富產(chǎn)品類型，來降低A2 奶的生產(chǎn)成本，同時(shí)做好A2 奶的科普宣傳工作，提升消費(fèi)意識(shí)。此外，要利用好天然牧場(chǎng)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)A2 基因型奶牛進(jìn)行篩選、培育和飼養(yǎng)，因地制宜生產(chǎn)天然A2 奶，采用先進(jìn)發(fā)展A2 奶生產(chǎn)地區(qū)帶動(dòng)后發(fā)展地區(qū)的合作模式，多方面、全方位滿足人們對(duì)乳制品營(yíng)養(yǎng)攝入的需求。