腭突上抬的發(fā)生及其分子生物學(xué)機(jī)制

王亞紅 李承浩 石冰

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科 成都 610041

腭裂是由腭發(fā)生異常所導(dǎo)致的最常見(jiàn)的先天性缺損之一。腭發(fā)生有原發(fā)腭和繼發(fā)腭之分。原發(fā)腭來(lái)源于額鼻突，包括人中和切牙孔前部的一小部分硬腭。繼發(fā)腭包括切牙孔之后的硬腭和軟腭，作為一種機(jī)械屏障分隔鼻腔和口腔，保持呼吸和吞咽功能的正常運(yùn)行。繼發(fā)腭的形成由腭突生長(zhǎng)、上抬及融合的一系列過(guò)程組成[1-4]。在小鼠胚胎發(fā)生期間，雙側(cè)上頜突于第11.5 d朝口腔側(cè)生長(zhǎng)形成腭突，雙側(cè)腭突沿舌兩側(cè)垂直向生長(zhǎng)至第14 d，迅速地上抬至舌背上方的水平位并向面部中線靠攏，胚胎第15～15.5 d，雙側(cè)腭突接觸，腭中縫形成，隨著中線上皮帶消失，雙側(cè)腭突完全融合，繼發(fā)腭形成。此外，繼發(fā)腭向上與原發(fā)腭結(jié)合，向下與鼻中隔融合，形成完整的腭[5-7]。任何過(guò)程的異常都會(huì)導(dǎo)致腭裂發(fā)生，其中90%的完全性腭裂是由腭突上抬失敗，繼而無(wú)法正常接觸融合所導(dǎo)致的[8]。

在過(guò)去的研究[9]中，對(duì)腭突上抬過(guò)程最全面的組織形態(tài)學(xué)研究是在大鼠體內(nèi)進(jìn)行的，無(wú)法使用遺傳學(xué)手段滿足機(jī)制研究的需求。近年來(lái)，小鼠的基因?qū)W研究方法及靶向突變模型的迅速發(fā)展，為探索腭發(fā)生、腭裂發(fā)生的機(jī)制提供了良好的平臺(tái)。盡管許多基因突變模型小鼠表現(xiàn)出異常（腭突上抬延遲或失?。?，與其相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制依然無(wú)明確的結(jié)論[4,10]。當(dāng)前的觀點(diǎn)在很大程度上仍然以組織形態(tài)學(xué)及各種體外研究結(jié)果為基礎(chǔ)[11]。本文就腭突上抬的發(fā)生及該過(guò)程所涉及的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 腭突上抬的發(fā)生過(guò)程

過(guò)去幾十年，關(guān)于腭突上抬如何發(fā)生及從何開(kāi)始始終存在爭(zhēng)議，最早學(xué)者們[12]普遍認(rèn)為是由腭突快速旋轉(zhuǎn)90°完成的；1940年Lazzaro提出上抬歸因于腭突遠(yuǎn)端以生長(zhǎng)為主的退化和水平方向上的延伸；Walker和Fraser則認(rèn)為腭突上抬的速度太快，無(wú)法用單純的生長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行解釋，而是腭突內(nèi)側(cè)壁形成突起而遠(yuǎn)端退化的重塑過(guò)程；隨后，Coleman[13]和Ferguson[1]提出了與先前觀點(diǎn)相反的“非均質(zhì)化”假說(shuō)，認(rèn)為腭突前份簡(jiǎn)單地向上翻轉(zhuǎn)上抬，而中后份經(jīng)歷了重塑和再定向的過(guò)程；Kochhar和Johnson[14]進(jìn)一步闡明了該假說(shuō)，認(rèn)為腭上抬開(kāi)始于腭突前份和后份2/3的交界處，然后沿兩側(cè)擴(kuò)展；2004年，Chou等[15]利用碳標(biāo)記的體外研究也表明組織重塑發(fā)生在腭發(fā)育的前份和后份；之后，Jin等[16]、Yu和Ornitz[11]通過(guò)大量的組織形態(tài)學(xué)研究后進(jìn)一步解釋了“非均質(zhì)化”假說(shuō)，認(rèn)為腭突上抬過(guò)程沿前后軸存在區(qū)域不均衡性，前份簡(jiǎn)單地向上翻轉(zhuǎn)，而中后份通過(guò)內(nèi)側(cè)壁水平向突出同時(shí)腹側(cè)壁后退來(lái)實(shí)現(xiàn)再定向。近期，Chiquet等[12]對(duì)腭突上皮和間充質(zhì)不同區(qū)域相關(guān)的分子標(biāo)志物表達(dá)模式的分析結(jié)果支持了這種區(qū)域特異性重塑模式假說(shuō)。具體來(lái)說(shuō)，經(jīng)比較上抬前后腭突中后份基因表達(dá)模式的差異，結(jié)果表明垂直腭突的整個(gè)舌側(cè)部分向中線移動(dòng)，而遠(yuǎn)端的間充質(zhì)最終移至腹外側(cè)[12,16]。此外，Brock等[17]對(duì)生長(zhǎng)至上抬階段小鼠腭突連續(xù)切片的研究結(jié)果表明，腭突開(kāi)始上抬時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞的方向在后份改變了近180°，而在前份改變了約90°。

近年來(lái)，腭突的上抬始于前份還是后份備受爭(zhēng)議。Brinkley和Vickerman[18]在體外的研究觀察到腭突的內(nèi)側(cè)部分首先上抬，然而Iseki等[19]、Kouskoura等[20]基于體內(nèi)的研究表明，舌體的運(yùn)動(dòng)對(duì)腭突上抬的影響很大。在同胞甚至同一個(gè)胚胎的兩側(cè)腭突之間，這將導(dǎo)致顯著的多變性[11,19,21]。最近，Yu和Ornitz[11]的一項(xiàng)組織形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為，腭突上抬始于中份到后份，然后向兩側(cè)延伸。

早在1940年，Lazzaro就提出兩側(cè)腭突的上抬是先后發(fā)生的，Walker和Fraser也提出了同樣的觀點(diǎn)。在之后開(kāi)展的研究中，Luke[21]、Greene和Kochhar[22]觀察到兩側(cè)腭突在非常短的時(shí)間內(nèi)依次上抬，通常一側(cè)腭突完全水平，而另一側(cè)腭突保持垂直，其遠(yuǎn)端遠(yuǎn)低于舌的背側(cè)，這一觀察也證實(shí)了腭突上抬是非同步發(fā)生的過(guò)程。

2 腭突上抬的驅(qū)動(dòng)機(jī)制

研究[18,22-23]證實(shí)，腭突有自發(fā)上抬的內(nèi)在能力，這表現(xiàn)在去除大腦和舌體的腭突能正常上抬，并且沿縱軸橫向切割的腭突部分能再定位。然而，驅(qū)動(dòng)該過(guò)程迅速發(fā)生的物理力量尚不清楚。目前，學(xué)者們已經(jīng)提出幾種假說(shuō)來(lái)解釋腭突上抬驅(qū)動(dòng)力的產(chǎn)生機(jī)制。

最早的研究[21]認(rèn)為，腭皺作為腭突的結(jié)構(gòu)支撐來(lái)提供腭突上抬的動(dòng)力。然而，He等[24]的研究表明，上抬不需要腭皺的參與，因?yàn)榍贸裆掀ぶ械慕?jīng)典Wnt信號(hào)通路基因?qū)е码癜櫟男纬蓡适В裢坏纳咸Ш腿诤喜⑽词艿礁蓴_；1974年，Lessard等[25]提出了以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架收縮在腭突上抬中的作用，類似于其他形態(tài)發(fā)生及組織重組中所觀察到的，該過(guò)程可能由上皮和間充質(zhì)共同的細(xì)胞骨架收縮提供動(dòng)力，然而這一想法從未得到證實(shí)；之后，學(xué)者們提出了幾個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)參與腭突上抬的假設(shè)，但沒(méi)有一個(gè)得到充分的證實(shí)。

1978年，F(xiàn)erguson[1,26]提出了流行至今的透明質(zhì)酸假說(shuō)，認(rèn)為透明質(zhì)酸在腭間充質(zhì)中的高水平積累是腭上抬的動(dòng)力來(lái)源，富含透明質(zhì)酸的細(xì)胞外基質(zhì)的水合作用使腭突膨脹，致使腭突前份快速翻轉(zhuǎn)上抬。Brinkley和Vickerman[27]利用藥理學(xué)方法增加腭突中透明質(zhì)酸的降解，使其在間充質(zhì)中的積聚水平下降，經(jīng)體外培養(yǎng)后，腭突后份上抬延遲，而前份未受影響，這表明細(xì)胞外基質(zhì)的水合作用在腭突前份上抬的過(guò)程中并未起主要作用，該研究認(rèn)為透明質(zhì)酸在腭突間充質(zhì)的特定區(qū)域中以較高的水平積累，并且產(chǎn)生滲透壓以驅(qū)動(dòng)腭突內(nèi)側(cè)向的組織重塑。之后，Lan等[6]利用生物素標(biāo)記的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白直接檢測(cè)透明質(zhì)酸在發(fā)育中的腭突間充質(zhì)中的分布，結(jié)果表現(xiàn)出顯著差異性。

此外，高爾基相關(guān)蛋白golgb1缺失的小鼠表現(xiàn)出腭突上抬失敗，同時(shí)腭間充質(zhì)中透明質(zhì)酸的積累顯著減少。Fgfr2的靶向點(diǎn)突變（Fgfr2C342Y/C342Y）小鼠表現(xiàn)出腭突上抬延遲，且腭間充質(zhì)中糖胺聚糖的積累減少[28]；新近的一項(xiàng)研究中，Li等[29]也觀察到Pax9敲除的小鼠腭突上抬失敗，同時(shí)透明質(zhì)酸在腭間充質(zhì)中積聚水平明顯下降，而同時(shí)敲除Wise則能挽救該過(guò)程，并使透明質(zhì)酸的積累得以恢復(fù)。

這些研究為糖胺聚糖的水平與腭突上抬的相關(guān)性提供了進(jìn)一步的證據(jù)，然而透明質(zhì)酸或其他糖胺聚糖是否參與產(chǎn)生腭突上抬的驅(qū)動(dòng)力仍有待證實(shí)。

Chiquet等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在腭突的中后份，肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維與遠(yuǎn)端和新形成的內(nèi)側(cè)壁突起之間的間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核方向保持一致，由此提出假設(shè)：以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架收縮提供腭突中后份上抬的驅(qū)動(dòng)力，而細(xì)胞外基質(zhì)在腭突的不同區(qū)域中所存在的組成和剛度的差異促使組織重塑；Nik等[30]在研究中也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxf2-/-小鼠腭突無(wú)法上抬，同時(shí)包括韌黏素-C和纖連蛋白在內(nèi)的幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著下降。該猜想仍需進(jìn)一步闡明。

3 腭突上抬的基因調(diào)控

研究表明，包含Msx1、Osr2、Pax9、Tbx1等轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的一些信號(hào)通路，如Sonic Hedgehog（Shh）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、Wnt、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等在腭突上抬的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[6-7,31-33]。

Shh和FGF10分別表達(dá)于腭突的上皮和間充質(zhì)內(nèi)，并在腭突上抬期間形成一個(gè)正向的反饋回路[34-35]。Msx1通過(guò)激活BMP4調(diào)節(jié)前份腭突間充質(zhì)細(xì)胞的增殖[36]。Tbx1在腭上皮和間充質(zhì)中強(qiáng)烈表達(dá)[37]，Tbx1-/-小鼠表現(xiàn)出腭突上抬障礙，最終腭裂發(fā)生，這可能與觀察到的腭突寬度減小、舌體高度增加、間充質(zhì)中透明質(zhì)酸積累減少、Fgf8表達(dá)升高、Fgf10表達(dá)下降及細(xì)胞增殖與凋亡行為的改變有關(guān)[38]。

Osr2和Pax9的表達(dá)遍及腭間充質(zhì)，是調(diào)控腭發(fā)生的關(guān)鍵因子[39-41]。Osr2和Pax9缺失的胚胎都表現(xiàn)出腭突上抬的失敗，同時(shí)伴有腭突間充質(zhì)細(xì)胞增殖的減少[40-41]。Ldb1缺失的小鼠腭突上抬失敗，且腭突間充質(zhì)中Pax和Osr2的mRNA表達(dá)明顯減少[42]。缺失Pax9的腭胚突的間充質(zhì)中BMP4、FGF10、Msx1、Osr2和上皮中Shh的mRNA水平都顯著下降[29]，然而恢復(fù)Osr2在腭突間充質(zhì)中的表達(dá)能夠在一定程度上挽救該過(guò)程[41]。此外，Li等[29]、Jia等[43]還觀察到Pax9缺失的胚胎發(fā)育過(guò)程中經(jīng)典Wnt通路信號(hào)降低，對(duì)DKK的藥物抑制以及對(duì)Wise的基因沉默，都能部分挽救Pax9缺失小鼠的腭發(fā)育缺陷。這意味著調(diào)控Pax9和Osr2下游的信號(hào)通路可能阻止腭裂發(fā)生。

Zfhx1a編碼一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，與包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β在內(nèi)多種信號(hào)通路有關(guān)，對(duì)腭突上抬起重要的促進(jìn)作用。Zfhx1a功能性喪失的小鼠表現(xiàn)出腭突上抬延遲24～48 h，最終導(dǎo)致腭裂，然而其生長(zhǎng)、分化和融合能力均無(wú)缺陷[44]。

Wnt-平面細(xì)胞的極性（planer cell polarity，PCP）途徑的某些因子缺失也能導(dǎo)致腭突上抬異常[45-47]，Wnt5a及其受體Ror2是腭發(fā)生中間充質(zhì)細(xì)胞向前定向遷移所必需的[45]。 Wnt5a-/-和Ror2-/-小鼠胚胎都表現(xiàn)出腭突上抬失敗[45]。此外，Wnt受體frizzled 1和frizzled 2缺失的小鼠表現(xiàn)出腭突上抬缺陷。約50%的Fz2-/-小鼠表現(xiàn)出腭裂，而Fz1-/-和Fz2-/-突變體均顯示腭裂，表明這些受體之間存在功能性冗余[46]。最近，Yang等[47]發(fā)現(xiàn)Pricke1作為PCP通路的另一個(gè)組成部分，其缺失會(huì)引起腭突上抬缺陷，最終表現(xiàn)腭裂。Liu等[48]對(duì)Gpr177的神經(jīng)嵴特異性失活也對(duì)腭突上抬造成干擾。PCP途徑的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)由Rac1、RhoA和CDC42介導(dǎo)[49]。研究[50]表明，腭突上抬前，Rac1水平在腭間充質(zhì)中呈區(qū)域差異性，且體外過(guò)表達(dá)Rac1培養(yǎng)的腭胚突表現(xiàn)出腭突上抬失敗。這些研究[7,32]表明，Wnt-PCP途徑引導(dǎo)的腭間充質(zhì)的形態(tài)發(fā)生在腭突上抬的過(guò)程中至關(guān)重要，該途徑對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)（如細(xì)胞遷移和細(xì)胞極性等）可能是腭突上抬的基礎(chǔ)。

Gsk3β在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，最顯著的是介導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的降解。對(duì)Gsk3β的靶向干擾導(dǎo)致完全性腭裂，而在胚胎第13.5～15 d利用化學(xué)方法使Gsk3β再表達(dá)，則能挽救腭裂的發(fā)生[51]。條件性敲除腭上皮中的Gsk3β，腭突無(wú)法上抬，且上皮細(xì)胞增殖下降、凋亡增加[52]。Gsk3β缺失不會(huì)影響Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的活性，上皮特異性敲除編碼β-連環(huán)蛋白的基因，未能對(duì)腭突上抬造成干擾，這表明Gsk3β可能通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白之外的途徑來(lái)調(diào)節(jié)腭的上抬[24,52]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）信號(hào)通路也在腭上抬中發(fā)揮重要作用。Fgfr2的靶向點(diǎn)突變（Fgfr2C342Y/C342Y）導(dǎo)致半側(cè)腭突的腭間充質(zhì)增殖減少，上抬延遲，最終發(fā)生腭裂[28]。ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通常作用于FGFR信號(hào)的下游，其有可能在Fgfr2C342Y/C342Y突變體中被過(guò)度活化。Spry20是ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，其干擾會(huì)導(dǎo)致腭突無(wú)法上抬，同時(shí)導(dǎo)致腭突前份的細(xì)胞增殖速率增加，這表明ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也在腭上抬中起重要作用[31]。

4 小結(jié)

近年來(lái)，通過(guò)分析基因突變模型和體外培養(yǎng)模型的基因表達(dá)變化，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控腭突上抬的基因及信號(hào)通路，但其潛在的分子生物學(xué)機(jī)制仍有待闡明，相關(guān)假設(shè)也有待證實(shí)。隨著高通量分子和生物化學(xué)研究的發(fā)展，以及對(duì)基因、蛋白質(zhì)、RNA和其他生長(zhǎng)因子認(rèn)知能力的提高，對(duì)調(diào)控腭發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)也將越來(lái)越深，這將有助于腭裂的預(yù)防及胚胎期治療，最終有效地防止腭裂發(fā)生。