16S 核糖體DNA 高通量測序研究種植體齦溝液微生物的變化

青薇 黃麗娟 鄭佳俊 任靜 李成龍 庹嬙 任小華 牟雁東,

1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 瀘州 646099；

2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 成都 610054；

3.四川省人民醫(yī)院口腔科 成都 610072

種植牙已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于牙列缺損和牙列缺失的患者，相關(guān)文獻(xiàn)[1]報道種植體植入后的存留率高。但隨著微生物黏附到種植體相關(guān)結(jié)構(gòu)，菌斑控制不佳，會導(dǎo)致種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎，最后導(dǎo)致骨質(zhì)流失和種植失敗[2-4]。有報道[5]表明，種植體植入5～10年之后，約20%的患者和10%的植入位點(diǎn)發(fā)生了種植體周圍炎。

齦溝液中的微生物是種植體周圍齦下微生態(tài)體系中的關(guān)鍵成分，研究種植體周圍齦下微生物多樣性對于探索種植體周圍炎癥的發(fā)生機(jī)制有重要意義[6]。作為一種不依賴培養(yǎng)的分子檢測技術(shù)，高通量測序具有分辨率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)[7-8]。近年來，隨著測序技術(shù)逐步提高和成熟，高通量測序技術(shù)得到了普遍應(yīng)用，在口腔齲壞、牙周炎和種植體周圍炎微生態(tài)的研究也逐步深入。種植體植入后疾病的發(fā)展是一個循序漸進(jìn)的過程，菌群的定植在不同的狀態(tài)下必然會有不同的體現(xiàn)[9-10]，基于此，筆者對于健康天然牙、健康種植體及發(fā)生種植體周圍炎對象的齦溝液菌群差異進(jìn)行了研究。

考慮到患者口腔內(nèi)常駐微生物群的個體差異，選擇在同一個體中研究種植牙健康狀態(tài)向疾病狀態(tài)轉(zhuǎn)變時相關(guān)微生物群的變化[11]。本研究篩選出10名患者口腔內(nèi)同時存在健康天然牙、健康種植體以及發(fā)生了種植體周圍炎的種植體為3組研究對象，應(yīng)用16S核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）高通量測序技術(shù)探究3組對象的微生物多樣性，以探討齦溝液微生物菌群的差異，為種植體周圍炎的精準(zhǔn)醫(yī)療提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例資料

本實驗篩選2016年1月—2018年1月就診并接受種植義齒修復(fù)的患者，同一受試者口內(nèi)至少同時存在健康天然牙、健康種植體和發(fā)生了種植體周圍炎的種植體，3個月內(nèi)未使用抗生素和免疫抑制類藥物，1個月內(nèi)未接受牙周和種植體周治療，全身狀況良好。成功種植體的納入標(biāo)準(zhǔn)為：種植體無動度，X線片示種植體周圍無透射區(qū)，垂直向骨吸收不超過種植體1/3，齦溝深度≤3 mm，探診出血（bleeding on probing，BOP）陰性。種植體周圍炎診斷如下：探診深度（probing depth，PD）≥5 mm，BOP陽性，X線片顯示種植體周圍牙槽骨吸收達(dá)3個螺紋，所有受試者自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 試驗材料和儀器

30#吸潮紙尖（登士柏公司，美國）；1.5 mL eppendorf（EP）管（Axygen公司，美國）；低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)）；高速臺式離心機(jī)（Thermo Fisher Pico-21；Thermo Fisher Scientific公司，美國）；E.Z.A.N.Mag-Bind Soil DNA試劑盒（Omega公司，美國）；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life Technologies公司，美國）；Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物有限公司）。

1.3 樣本采集

由同一位口腔醫(yī)師經(jīng)技術(shù)培訓(xùn)后采集齦溝液。標(biāo)本的采集時間均為上午（采集當(dāng)日要求受試患者暫停刷牙等口腔衛(wèi)生維護(hù)措施），刮除預(yù)備牙體齦緣區(qū)著色菌斑，隔濕條件下用統(tǒng)一規(guī)格無菌紙尖浸入頰側(cè)近中齦溝40 s采集標(biāo)本，迅速放入消毒好EP管中（收集樣本時沾有血漬和被唾液污染的樣本排除），做好標(biāo)記，置入-80 ℃冰箱中備用。

1.4 操作方法

1.4.1 齦溝液細(xì)菌16S rDNA V1-V3基因片段多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 按照提取試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行總DNA提取，溶解于100 μL去離子水，利用Qubit 2.0檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。

PCR所用引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V1-V3通用引物：V1F引物（5’ATCTGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和V3R引物（5’GAGAATTCCAACCGCGGCKGCTGGC-3’）。50 μL PCR反應(yīng)體系：上游引物和下游引物各2 μL，Dream Taq PCR Master Mix 25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入35個循環(huán)擴(kuò)增階段，每個循環(huán)包括變性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，最后于72 ℃保溫7 min。PCR結(jié)束后，引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，然后按照1：1等量混合后測序。

1.4.2 齦溝液細(xì)菌16S rDNA基因測序 齦溝液微生物擴(kuò)增DNA送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行Illumina HiSeq 2500高通量測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效序列（effective tag）進(jìn)行聚類[12]，以97%的一致性將序列聚類成為運(yùn)算分類單位（opera tional taxonomic units，OTU）；對OTU代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur軟件和GreenGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），構(gòu)建稀釋曲線，利用QIIME軟件計算樣品Alpha多樣性值[13]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

組間Alpha多樣性兩兩進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，菌群水平差異兩兩進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征及臨床檢查指標(biāo)

納入實驗研究對象共10名，其中男性6名，女性4名，年齡（60.1±1.7）歲；共收集30份齦溝液，分別編號為健康天然牙組（H組）、健康種植體組（HI組）以及種植體周圍炎組（PI組）?；颊呋咎卣骷芭R床檢查詳見表1。

表1 患者基本特征及臨床檢查指標(biāo)Tab 1 Characteristics of patients and clinical data

2.2 測序結(jié)果質(zhì)量分析

通過對30個樣品進(jìn)行測序，原始序列條數(shù)為764 678；過濾掉低質(zhì)量的序列后，有效序列的總數(shù)為764 230，產(chǎn)生1 906～3 132個OTU，有效序列比例均大于98%；質(zhì)量篩查之后序列長度大部分分布在400～600 bp，平均長度均在440 bp以上，滿足分析要求（圖1）。從稀釋曲線（圖2）中可知，序列數(shù)量到1 500時，各樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣合理，能夠較真實地反映齦溝液樣本的細(xì)菌群落。

圖1 原始數(shù)據(jù)長度分布圖Fig 1 Length of distribution of raw reads

圖2 樣本稀釋曲線圖Fig 2 Rarefaction curves of three groups

2.3 各樣品中細(xì)菌多樣性及相關(guān)性分析

3組樣本的Alpha多樣性指數(shù)如表2所示，Shannon指數(shù)顯示H組高于PI組（P＜0.05），HI組高于PI組（P＜0.01），見圖3。

圖3 3組的Shannon指數(shù)差異Fig 3 Shannon indices in three groups

表2 3組樣本的Alpha多樣性指數(shù)Tab 2 Alpha diversity indices calculated for three groups

2.4 主成分分析

由圖4可以看出，H組和HI組的主成分較類似，出現(xiàn)個別交叉，PI組則與H組和HI組相對獨(dú)立，基本無交叉，說明PI組的菌群結(jié)構(gòu)相較來說確實存在不同。

圖4 主成分分析Fig 4 Principal component analysis of three groups

2.5 門水平菌群組成分析

3組樣本共檢測到細(xì)菌門17個，其中豐度較高的前5個門分別為：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），具體所占比例如圖5所示。PI組齦溝液中擬桿菌門占比高于H和HI組（P＜0.05）。3組之間的優(yōu)勢菌門對比如圖6所示。

2.6 屬水平菌群組成分析

在屬的水平上，總共497個類群被分類，部分屬熱圖如圖7所示，可見在PI組中檢出較高的有普氏菌屬（Prevotella）、密螺旋體屬（Treponema）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、放線菌屬（Actinomyces）、鏈球菌屬（Streptococcus）和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等，且與HI組和H組相應(yīng)菌屬豐度進(jìn)行對比，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），對3組相關(guān)致病菌屬進(jìn)行比較，具體如圖8所示。

圖5 樣品在門分類水平上細(xì)菌類群比較Fig 5 Comparison of bacterial groups in each sample at pylum level

圖6 優(yōu)勢菌門的比較Fig 6 Comparison of dominant bacteria in three groups

圖7 屬水平的熱圖比較Fig 7 Comparison of heatmap in three groups at genus level

3 討論

種植體周圍炎作為種植修復(fù)后最常見的并發(fā)癥，是影響種植修復(fù)成敗的重要因素之一，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致種植體脫落[14]，因此理解種植體周圍組織從健康至疾病狀態(tài)的復(fù)雜病因是必要的。牙周病學(xué)研究[15]發(fā)現(xiàn)，齦溝液量及其成分能夠反映牙周炎癥情況，認(rèn)為齦溝液量的變化與牙周病的發(fā)展有關(guān)。齦溝液中的微生物是種植體周圍齦下微生態(tài)體系中的關(guān)鍵成分，與種植體植入后組織健康有著密切關(guān)系。因此，在本次研究中，選擇同一個體對比不同健康狀態(tài)齦溝液內(nèi)微生物群的轉(zhuǎn)變，共納入10名患者為研究對象。

Illumina Miseq高通量測序平臺的測序原理精確、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，用于研究復(fù)雜樣品的微生物群落的組成，具有先進(jìn)性[16]。在16S rRNA克隆文庫法測序的結(jié)果中，總測序只有幾百至一千多個克隆[17]。相比而言，高通量測序深度明顯要高于變性梯度凝膠電泳 （denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）或16S rRNA克隆文庫[18]等方法。

圖8 樣品在屬分類水平上細(xì)菌類群比較Fig 8 Comparison of bacterial groups in each sample at genus level

Alpha多樣性是指在一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，經(jīng)常用物種豐富度來表示，其中Shannon指數(shù)反映每個物種個體數(shù)占群落中總個體數(shù)的比例，Shannon指數(shù)越大，則表示該樣品中的物種多樣性更高[19]。H組和HI組的Shannon指數(shù)皆顯著高于PI，表明H組和HI組齦溝液中細(xì)菌的豐富度和多樣性都要高于PI組，且其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PI組細(xì)菌表現(xiàn)出較低的多樣性，物種數(shù)量最少，這表明種植體周圍炎是一種核心致病菌參與的簡單感染。然而，這些核心致病菌在所有個體中并不相同，表明該疾病是微生物異質(zhì)的。既往研究[20]發(fā)現(xiàn)，疾病狀態(tài)下環(huán)境微生物群落的多樣性會比健康狀態(tài)下的多樣性降低，這可能是因為病原微生物的聚集，從而形成核心致病群體（比如紅色復(fù)合體和黃色復(fù)合體）。

在細(xì)菌門分類水平上，已知厚壁菌、擬桿菌和變形桿菌是牙周炎患者的主要齦下菌門分類[21-22]，本研究結(jié)果也證實了3個實驗組中的菌群中以該3種菌門為主，其中擬桿菌門在H和HI組豐度較低，在PI組相對較高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。雖然變形桿菌和放線桿菌在PI組中出現(xiàn)了數(shù)量增高的趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要菌群之一，是齦下菌群的主要構(gòu)成成分，其在疾病狀態(tài)下增多，這與Koyanagi等[17]的研究結(jié)果一致。Koyanagi等[17]對比了6例種植體周圍炎和牙周炎患者的齦下菌斑，表明相較于牙周組織周圍，種植體周圍存在更復(fù)雜的微生物組成，而且以變形桿菌為主的幾種細(xì)菌是種植體周圍炎的致病菌屬。Kumar等[10]則指出種植體周圍炎是一種以革蘭氏陰性菌為主的微生物導(dǎo)致的感染，但致病菌種類不像牙周炎那么復(fù)雜，是一種以個別優(yōu)勢菌致病的簡單感染。

在細(xì)菌屬水平上，某些牙周炎的重要致病菌屬（比如密螺旋體、普氏菌、彎曲桿菌）在本次研究中檢測出為種植體周圍炎的致病菌屬，從某種意義上說明牙周炎和種植體周圍炎的致病菌屬確實相似[23]，但在本次實驗中檢測到種植體齦溝液中一些特殊的優(yōu)勢菌屬（纖毛菌、變形鏈球菌和丁酸弧菌）。丁酸弧菌是人胃腸道中的丁酸鹽生產(chǎn)者，其作為健康牙和種植牙共有的菌屬尚未見報道，而本次研究在每個種植體齦溝液中均檢測到它的存在，而且與HI組相比，這些物種的水平在PI組中更高。有趣的是，筆者還觀察到丁酸弧菌與密螺旋體之間有很強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.69），丁酸弧菌的代謝產(chǎn)物異丁酸是密螺旋體的重要生長需求，這可能提示異丁酸的增多，將會有益于密螺旋體的生長，進(jìn)而促進(jìn)有害菌群的增殖、聚集，促進(jìn)疾病狀態(tài)的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)提示應(yīng)對齦溝液內(nèi)丁酸鹽生產(chǎn)者菌屬進(jìn)行深入研究，探討其致病機(jī)制及對治療的影響。

4 結(jié)語

綜上所述，本研究采用16S rDNA高通量測序研究了30例健康天然牙、健康種植體和種植體周圍炎病例，共檢測到包含17個門，177個科共497個屬的細(xì)菌。健康種植體呈現(xiàn)出豐富的微生物多樣性，與健康天然牙一致；而當(dāng)種植體周圍組織遭受致病菌引起的炎癥后，表現(xiàn)為相關(guān)致病菌豐度增高，而其多樣性下降。與此同時，種植體周圍炎由于受到解剖位置及病理因素的影響，其致病相關(guān)微生物與牙周致病微生物存在聯(lián)系，但仍可能有其他的致病微生物參與病變的進(jìn)程。種植體周圍炎優(yōu)勢菌屬在該疾病發(fā)生、發(fā)展中的功能值得進(jìn)一步深入研究。