非編碼RNA 在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中作用的研究進展

張凱瑩 房付春,2 吳補領(lǐng),2

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔科 廣州 510515；

2.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 廣州 510515

牙源性干細胞是從口腔組織中分離出來的成體干細胞，包括牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脫落乳牙干細胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、根尖乳頭干細胞（apical papilla stem cell，SCAP）、牙囊前體細胞（dental follicle progenitor cell，DFPC）、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）等，具有自我更新和多向分化的潛能[1]。在某些生物因素影響下，或當牙體組織受到創(chuàng)傷和不可逆性的齲病損害時，牙源性干細胞（尤其是DPSC）能分化為新的成牙本質(zhì)細胞，分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，進而形成修復(fù)性牙本質(zhì)。

在體外特定條件下，培養(yǎng)的牙源性干細胞能分化為成牙本質(zhì)樣細胞，具有高的克隆、增殖和形成致密鈣化克隆團甚至是鈣化結(jié)節(jié)的能力，此過程被稱為成牙本質(zhì)向分化[2]。此過程涉及多種轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機制[3]。研究牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化機制為組織工程和再生醫(yī)學提供了新思路。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)對細胞生命過程起調(diào)控作用的RNA，目前研究較多的ncRNA包括了長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA/miR）、環(huán)狀RNA（circle RNA，circ-RNA）、Piwi-interacting RNA（piRNA）等。其共同點是能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白質(zhì)，在RNA水平上行使各自的生物學功能[4]。近年來，關(guān)于ncRNA在膀胱、直腸等組織器官的作用機制的研究開展得比較廣泛，特別是在癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面研究得比較深入[5-6]。雖然ncRNA在牙源性干細胞中功能和機制的探討較少，但事實上ncRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化作用中發(fā)揮了重要作用，其往往通過成牙本質(zhì)相關(guān)基因或相關(guān)通路發(fā)揮調(diào)控作用（表1）。

表1 ncRNA參與牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化調(diào)控Tab 1 Regulation of ncRNAs on odontoblastic differentiation of dental tissue-derived stem cells

1 lncRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

lncRNA轉(zhuǎn)錄本長度超過200核苷酸（nucleotide，nt），有的甚至超過10 000 nt，數(shù)量占ncRNA的80%以上。lncRNA通過與DNA/RNA或者與蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)編碼蛋白質(zhì)的基因的表達[7-8]，改變干細胞多向分化的能力，最終影響細胞的增殖、分化，乃至機體的生長、發(fā)育、衰老、死亡等重要生命活動以及疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。

在細胞質(zhì)中，lncRNA的功能和潛在機制包括：調(diào)節(jié)信使RNA（messenger RNA，mRNA）的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)翻譯過程，作為競爭性內(nèi)源RNA，作為miRNA的前體，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)修飾過程[10]。

在細胞核中，lncRNA的調(diào)節(jié)機制包括：作為轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)蛋白的誘餌，作為RNA蛋白復(fù)合物的支架，通過招募染色質(zhì)修飾因子成為表觀遺傳調(diào)控因子[11]。

1.1 lncRNA在人牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

2012年，Kretz等[12]發(fā)現(xiàn)了一種lncRNA，在人外胚層細胞分化時下調(diào)，并且需要保持外胚層干細胞或成骨細胞處于未分化的狀態(tài)，將其命名為反分化非編碼RNA（antidifferentiation non-protein coding RNA，ANCR），后更名為拮抗分化非編碼RNA（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR）。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的DANCR可通過作用于靶基因果蠅zeste基因增強子同源物2（enhancer of zestehomolog 2，EZH2）以及調(diào)控RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表達來促進成骨分化。Chen等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的DANCR顯著降低了糖原合成酶激酶3β的絲氨酸磷酸化（Ser9 phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達，提示DANCR可通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的活性進而抑制成牙本質(zhì)向分化。

另外，lncRNA H19是轉(zhuǎn)錄自人類染色體11p15.5的H19/lgf2基因族的lncRNA，在細胞核和細胞質(zhì)中均發(fā)揮多種功能活性[15]。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19可以與S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH）作用，H19/SAHH途徑調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）3B介導的同源盒轉(zhuǎn)錄因子（distal-less homeobox，DLX）3的基因甲基化和表達，從而在表觀遺傳水平促進DPSC成牙本質(zhì)向分化。而Li等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19可競爭性結(jié)合miR-141，并阻止精子相關(guān)抗原（spermassociated antigen，SPAG）9發(fā)生miR-141介導的降解，從而提高p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化水平，進而促進人SCAP成骨/成牙本質(zhì)向分化。

此外，也有學者[18]發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，人DPSC成骨/成牙本質(zhì)向分化下調(diào)；進行ncRNA表達譜生物學分析，結(jié)果顯示20個lncRNA表達上調(diào)，27個lncRNA表達下調(diào)；構(gòu)建lncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵lncRNA 6-12白血病分子（six-twelve leukemia，STL），驗證了沉默STL將抑制成骨/成牙本質(zhì)向分化，并可能通過醌還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶[nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): quinone oxidoreductase，NQO]1及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（endoplasmic reticulum oxido re ductin，ERO）1發(fā)揮作用。

因此，lncRNA在人牙組織來源干細胞分化過程中的調(diào)控機制以及調(diào)控的多條途徑之間的關(guān)聯(lián)可能成為今后的研究熱點。

1.2 lncRNA在小鼠牙間充質(zhì)干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

2016年，Zheng等[19]研究了與小鼠牙間充質(zhì)干細胞成牙本質(zhì)向分化相關(guān)的lncRNA，利用RNA測序比較新鮮分離的與培養(yǎng)的牙髓間充質(zhì)干細胞的lncRNA表達譜，對差異表達的lncRNA與編碼RNA進行共表達分析，發(fā)現(xiàn)在新鮮分離的牙髓間充質(zhì)干細胞中，共有108個lncRNA上調(diào)表達，36個lncRNA下調(diào)表達。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定可知，培養(yǎng)的與新分離的牙髓間充質(zhì)干細胞相比，在培養(yǎng)的牙髓間充質(zhì)干細胞中，母系印記基因3（maternally imprinted genes 3，Meg3）、肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-asso ciated lung adenocarcinoma transcript 1，Malat1）、 X（染色體）失活特異性轉(zhuǎn)錄物（X-inactive specific transcript，Xist）和反義遠端同源盒轉(zhuǎn)錄因子1（distal-less homeobox 1 antisense，Dlx1as）等與成牙本質(zhì)向分化相關(guān)的基因顯著下調(diào)，而在具有較強成牙本質(zhì)向分化潛能的牙源性牙髓間充質(zhì)組織中表達上調(diào)。提示lncRNA失調(diào)可能與牙間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)過程中成牙本質(zhì)向分化潛能的喪失有關(guān)。此外，Dlx1上游生長因子成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）8可誘導牙髓間充質(zhì)干細胞中Dlx1as的下調(diào)和Dlx1的上調(diào)，這表明Dlx1as與牙髓間充質(zhì)干細胞中的Dlx1含量呈負相關(guān)，因此Dlx1和Dlx1as的表達可能存在相反的功能表型。

2 miRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

miRNA是一類廣泛存在于真核生物基因組，長度為20～24 nt的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA[20]。在產(chǎn)生miRNA的經(jīng)典途徑中，存在于細胞核中的原始miRNA（pri-miRNA）能被核糖核酸酶Ⅲ Drosha和狄喬治氏綜合征相關(guān)蛋白8抗體（DiGeorge syndrome-related proteins 8 antibody，DGCR8）識別并裂解為前體miRNA（pre-miRNA），經(jīng)RNA酶ⅢDicer進一步處理成為成熟miRNA[21]。研究[22]顯示，成熟miRNA通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)堿基互補配對結(jié)合，導致mRNA降解或者翻譯過程受到抑制，從而負調(diào)控靶基因的表達。在人類基因組中，大約1 000種miRNA被鑒別出，人類多達30%的基因受miRNA所調(diào)節(jié)[23-24]。

2.1 miRNA在人牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

近年已有研究表明部分miRNA可促進人牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化。Xu等[25]研究在低濃度腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α介導下，miR-21和信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（transducer and activator of transcription，STAT）3表達上調(diào)，上調(diào)的miR-21協(xié)同STAT3來調(diào)控人DPSC成牙本質(zhì)向分化，構(gòu)成miR-21/STAT3信號通路。也有研究[26]發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4發(fā)生解離，從而抑制轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β信號通路的細胞內(nèi)效應(yīng)器Smad3，進而促進人DPSC成牙本質(zhì)向分化。

此外，部分miRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化過程中表達下調(diào)。有學者研究miR-143-5p抑制成牙本質(zhì)向分化的相關(guān)機制。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的miR-143-5p可降低與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）14的結(jié)合，促進MAPK14表達，激活p38 MAPK信號通路以促進成牙本質(zhì)向分化。Zhang等[28]探究miR-143-5p在人DPSC成牙本質(zhì)向分化中通過骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand，RANKL）信號通路直接作用于RUNX2的機制。雙熒光酶素報告顯示，RUNX2是miR-143-5p的直接作用靶基因；進一步實驗顯示，在轉(zhuǎn)染了pMIR-miR-143-5p抑制體質(zhì)粒的人DPSC中，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達活力增強，鈣化結(jié)節(jié)形成增多，牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、RUNX2和OPG表達上調(diào)，而RANKL表達下調(diào)，細胞侵襲遷移能力以及黏附能力增強，提示下調(diào)的miR-143-5p通過OPG/RANKL信號通路上調(diào)RUNX2的表達，進而促進人DPSC成牙本質(zhì)向分化。此外，在IGF1處理的人SCAP中，hsa-let-7c可通過胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）-1/胰島素樣生長因子-1受體（insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R）/hsa-let-7c軸，抑制JNK和p38 MAPK信號通路，進而抑制成牙本質(zhì)向分化[29]。

2.2 miRNA在小鼠牙間充質(zhì)干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

在小鼠模型中，Li等[30]發(fā)現(xiàn)miR-3065-5p在成牙本質(zhì)向分化過程中上調(diào)。雙熒光酶素報告顯示，miR-3065-5p與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ型（bone mor phogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）的3’端相結(jié)合，BMPR2在成牙本質(zhì)向分化早期表達增多，而在晚期則表達劇烈下降。由此證實了小鼠模型中miR-3065-5p可部分通過BMPR2調(diào)控成牙本質(zhì)向分化。

3 circRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的作用

circRNA是一類特殊的ncRNA分子，大量存在于真核細胞中，是由前體mRNA通過特殊的選擇性剪切產(chǎn)生的，與傳統(tǒng)線型RNA不同，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩(wěn)定，因此成為新的生物學標記物[31]。

目前關(guān)于circRNA在人DPSC成牙本質(zhì)向分化中的功能及機制的探討較少，尚停留在小鼠模型上，且多以基因芯片和生物信息學分析為主，但伴隨著新的研究技術(shù)體系的建立，circRNA在人DPSC成牙本質(zhì)向分化中的機制將進一步得以闡明。占云燕等[32]對小鼠牙乳頭細胞向成牙本質(zhì)細胞分化過程中的circRNA的表達譜進行了研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)礦化誘導的牙乳頭細胞中，差異表達的circRNA共4 064條，其中3 255條上調(diào)表達，809條下調(diào)表達。分析其中上調(diào)circRNA來源基因，發(fā)現(xiàn)很多基因與牙的發(fā)育過程及硬組織礦化相關(guān)。

4 ncRNA在牙源性干細胞成牙本質(zhì)向分化中的研究展望

綜上所述，牙源性干細胞的成牙本質(zhì)向分化會受到多種ncRNA的調(diào)控，兼有抑制或促進效應(yīng)，其機制既包括直接作用于成牙本質(zhì)向分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，也有間接作用于轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因素，甚至構(gòu)成反饋環(huán)路發(fā)揮調(diào)控作用。lncRNA、miRNA和circRNA關(guān)系密切，它們彼此相互作用，在人體內(nèi)構(gòu)成一個復(fù)雜而精準的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系。近年來關(guān)于內(nèi)源性競爭RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）的作用機制探討較多，lncRNA和circRNA甚至某些miRNA均可發(fā)揮miRNA分子海綿作用，調(diào)控宿主基因表達[31,33-34]。筆者認為，關(guān)于ncRNA對成牙本質(zhì)向分化的相關(guān)調(diào)控因素作用方面的研究，不僅有助于深入探究ncRNA這一參與許多重要生命活動的調(diào)控因子，也將有利于為牙源性干細胞的再生治療提供新的思路和方法。另外，關(guān)于尋找ncRNA結(jié)構(gòu)和功能的更高效的研究方法，也將會成為ncRNA今后的研究熱點和重點。