血流感染病原微生物診斷技術(shù)的研究與應(yīng)用

章 波，伊貝拜汗·買賣提 綜述,張 新△ 審校

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊830002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000)

血流感染(BSI)是一種發(fā)病率及病死率高的病原微生物全身感染性疾病[1]。研究表明，延遲、不足或不適當(dāng)?shù)目垢腥局委熍cBSI患者病死率增加有關(guān)[2]。雖然在感染24 h內(nèi)經(jīng)驗(yàn)性治療能改善患者預(yù)后，但可導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)和傳播，并增加侵襲性真菌感染的機(jī)會[3]。因此，正確且及時(shí)的抗感染治療對患者的生存和抑制病原微生物的耐藥性至關(guān)重要。BSI病原微生物的快速鑒定和藥敏試驗(yàn)是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室最重要的任務(wù)之一，對于BSI病原微生物快速鑒定、藥敏技術(shù)的研究及臨床應(yīng)用應(yīng)引起檢驗(yàn)人員的高度關(guān)注。本文討論了病原微生物診斷的最新技術(shù)研究，為促進(jìn)BSI的診斷和治療提供新的視角。

1 基于血培養(yǎng)的病原微生物檢測技術(shù)

血培養(yǎng)仍然是BSI病原微生物診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但血培養(yǎng)儀陽性報(bào)警后，需分離純化病原微生物進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，因而導(dǎo)致報(bào)告結(jié)果周期長。目前，已有較多方法可快速鑒定陽性血培養(yǎng)中的病原菌，這些檢測方法簡化了常規(guī)血培養(yǎng)的工作流程，縮短了結(jié)果報(bào)告時(shí)間。

1.1陽性報(bào)警時(shí)間(TTP)的應(yīng)用 TTP是指從血培養(yǎng)瓶放入監(jiān)測系統(tǒng)到儀器報(bào)告陽性的時(shí)間。根據(jù)不同微生物在血培養(yǎng)瓶中生長速度的快慢，利用TTP可初步推斷微生物的類型。謝香梅等[4]統(tǒng)計(jì)大腸桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、鏈球菌及真菌等各有不同的TTP，結(jié)合革蘭染色可對BSI病原微生物類型進(jìn)行初步鑒定。同時(shí)TTP對于鑒別分離菌株是否為污染菌具有一定的參考價(jià)值，朱珠等[5]對1 300例BSI分離菌株的TTP、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及臨床資料進(jìn)行綜合分析，并將這些細(xì)菌分為感染菌組與污染菌組，兩組比較TTP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)血培養(yǎng)瓶TTP的早晚可對病原微生物進(jìn)行初步鑒定或判斷是否存在污染菌的情況等受諸多因素的影響，如抗菌藥物的使用、標(biāo)本含菌量、取樣時(shí)間、取樣量等，因此其在臨床的應(yīng)用仍有待于不斷研究。

1.2顯色培養(yǎng)基 顯色培養(yǎng)基是根據(jù)微生物自身代謝產(chǎn)生酶的特征而設(shè)計(jì)的一種分離培養(yǎng)基，通過直接觀察菌落顏色即可對菌株做出鑒定。目前，除了針對沙門菌、念珠菌屬、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、艱難梭菌、彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等的特殊顯色培養(yǎng)基外，還有用于篩選耐藥性病原菌的顯色培養(yǎng)基，如耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶的腸桿菌等。將自動血培養(yǎng)儀與涂片鏡檢、顯色培養(yǎng)基結(jié)合起來，可縮短對血培養(yǎng)中陽性病原菌檢測時(shí)間。陳榮等[6]采用顯色培養(yǎng)基檢測血培養(yǎng)中MRSA，結(jié)果提示該方法與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定方法及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測結(jié)果的符合率高，特異度為98.8%，靈敏度為97.9%，同時(shí)該方法將實(shí)驗(yàn)室診斷MRSA BSI的平均報(bào)告時(shí)間提前1 d。

1.3基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是依據(jù)微生物生物標(biāo)志蛋白各自特異度肽質(zhì)量指紋圖譜的不同，通過與商業(yè)化的參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)而確定待測微生物的種屬。該技術(shù)對陽性血培養(yǎng)中病原菌分離純化后進(jìn)行鑒定僅需幾分鐘，并且對臨床常見細(xì)菌鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到90%～95%[7]。對從陽性血培養(yǎng)中病原菌不分離純化直接鑒定而言，也僅需幾十分鐘，但該方法仍需探索以提高檢測的準(zhǔn)確性。馬堅(jiān)等[8]采用MALDI-TOF MS直接檢測312份陽性血培養(yǎng)中病原菌，與常規(guī)方法比較，屬水平鑒定符合率僅為84.0%，種水平符合率為64.7%，對革蘭陽性菌鑒定準(zhǔn)確率不佳且低于革蘭陰性菌。MALDI-TOF MS對檢測病原菌耐藥性也有潛在的幫助，如檢測β-內(nèi)酰胺酶或碳青霉烯類耐藥菌、檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因及毒力因子以及區(qū)分萬古霉素敏感和萬古霉素耐藥腸球菌等[3]。盡管MALDI-TOF MS現(xiàn)已成為臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定微生物的有效工具，但依然存在諸多問題，如病原菌肽質(zhì)量指紋圖譜重復(fù)性問題、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫亟待完善及細(xì)菌耐藥性研究應(yīng)用于臨床等均需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善。

1.4熒光原位雜交(FISH)技術(shù) FISH是一種利用熒光標(biāo)記探針對不同病原微生物的rRNA分子進(jìn)行靶向雜交的技術(shù)。該技術(shù)可用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌屬、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、布魯菌屬和真菌等微生物的檢測。目前已有較多商業(yè)性試劑盒可用于直接鑒定陽性血培養(yǎng)中特定病原菌，如PNA-FISH?(AdvanDx)、Quick FISH?(AdvanDx)、The AccuProbe system?(Hologic)、Accelerate DiagnosticsTM(Arizona)等，這些均可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成陽性血培養(yǎng)分離菌株的檢測，檢測的靈敏度和特異度可達(dá)到96%～100%[9]。一項(xiàng)多中心研究中，用肽核酸熒光原位雜交法(PNA-FISH)檢測陽性血培養(yǎng)中分離的355株腸球菌，檢測特異度和靈敏度分別為100%和97%[10]。盡管該技術(shù)在陽性血培養(yǎng)病原微生物檢測中表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景，但可用的特異度探針數(shù)量有限，一些微生物只能在屬的水平上鑒定，并且缺乏所鑒定微生物的抗菌藥物敏感信息。

1.5核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種體外擴(kuò)增核酸片段的技術(shù)，以PCR技術(shù)最為常用，可從血液或陽性血培養(yǎng)中直接進(jìn)行病原微生物鑒定及耐藥基因的檢測，具有較高的特異度和靈敏度[11]。該技術(shù)通常是使用特異引物擴(kuò)增病原微生物目標(biāo)基因或使用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌(16S/23S)或真菌(18S)基因組的保守rRNA區(qū)域，隨后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、高分辨率熔解曲線、微陣列雜交或基因測序等分析。MASEK等[12]使用PCR方法聯(lián)合高分辨率熔解曲線分析有效地檢出BSI中沙門菌。MOORE等[13]檢測1 130份疑似菌血癥患者血樣，采用PCR擴(kuò)增病原菌16S和/或23S rRNA，然后進(jìn)行焦磷酸測序，該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的一致性為96.9%，靈敏度為77.8%，特異度為99.3%。

由PCR衍變相關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)也廣泛用于BSI病原微生物檢測，如實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等。這些方法提高了PCR的靈敏度、特異度和檢測速度，更有利于BSI中多重病原微生物的檢測，同時(shí)也可對常見耐藥基因檢測，如mecA、vanA/B、vanC1/C2/C3、blaKPC、blaNDM-1、blaVIM或blaIMP等。胡翀等[14]采用多重PCR法鑒定200份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本，約4 h可完成細(xì)菌鑒定，與傳統(tǒng)血培養(yǎng)法結(jié)果符合率為100.0%；任春陽等[15]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)直接檢測300份陽性血培養(yǎng)瓶中大腸埃希菌，檢出時(shí)間約1 h，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，靈敏度和特異度均達(dá)100.0%。

目前，已有較多基于PCR技術(shù)的商業(yè)性平臺應(yīng)用于陽性血培養(yǎng)中病原微生物鑒定及耐藥基因的直接檢測，如FilmArray?(bioMérieux，F(xiàn)rance)、The GeneXpert?MRSA/SA BC assay(Cepheid，USA)、BD MaxTM StaphSR Assay(BD，Canada)、Cognitor?Minus(Momentum Bioscience，UK)和Eazyplex?(Amplex ByoSistems GmbH，Germany)等。雖然這些商業(yè)性平臺提高了檢測速度，但仍然無法擺脫P(yáng)CR方法的局限性，如血液中PCR抑制劑及污染物DNA或死亡微生物的DNA的存在等影響檢測結(jié)果；在病原菌未明的情況下，難以做到逐一檢測用于BSI多重病原菌感染的診斷。其次，在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用上也受多種因素限制，如基層實(shí)驗(yàn)室條件限制、PCR試劑盒診斷價(jià)格和某些技術(shù)平臺國內(nèi)批準(zhǔn)文號等。

1.6基因芯片(DNA微陣列) DNA微陣列由固定在固體表面特異度DNA探針組成，通過識別待分析靶DNA與陣列雜交的熒光信號從而對多種病原微生物進(jìn)行檢測，同時(shí)該技術(shù)也用于檢測耐藥基因和基因分型。目前，DNA微陣列可檢測90%～95%已知導(dǎo)致BSI的病原菌，靈敏度范圍為101～105個(gè)細(xì)胞/mL，適用于陽性血培養(yǎng)中病原微生物檢測[16]。

已有用于臨床陽性血培養(yǎng)中病原微生物檢測的商品化基因芯片，如Prove-itTMSepsis (Mobidiag，F(xiàn)inland)可在3.5 h內(nèi)檢測60種細(xì)菌和30種真菌，并且可檢測mecA、vanA、vanB耐藥基因，靈敏度和特異度分別達(dá)到95.0%和99.0%[17]，但該商品盒目前已停產(chǎn)。另一種是美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)基于DNA微陣列的Verigene?系統(tǒng)(Nanosphere，USA)，該系統(tǒng)用于檢測12種革蘭陽性菌以及相關(guān)耐藥基因(mecA、vanA和vanB)和另外9種革蘭陰性細(xì)菌(1種未經(jīng)FDA批準(zhǔn))及其耐藥基因(blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA和blaCTX-M)，可在2.5 h內(nèi)直接從陽性血培養(yǎng)中識別細(xì)菌及其相關(guān)耐藥基因，靈敏度為92.6%～100.0%，特異度94.3%～100.0%[18]。然而，昂貴的基因芯片及檢測儀器嚴(yán)重限制了這種技術(shù)的臨床普及與應(yīng)用。

1.7綜合檢測平臺 近年來，結(jié)合不同的分子生物學(xué)技術(shù)而開發(fā)的綜合檢測平臺已用于臨床陽性血培養(yǎng)中病原微生物直接檢測。如Sepsis Flow Chip (Master Diagnostica，Spain)利用多重PCR和低密度DNA微陣列技術(shù)，可在3 h內(nèi)同時(shí)檢測36種細(xì)菌、念珠菌屬(白色念珠菌和其他念珠菌屬)和20種耐藥基因。GALIANA等[19]對該檢測方法進(jìn)行性能評價(jià)，細(xì)菌鑒定的靈敏度和特異度分別為93.3%和100.0%，檢測耐藥基因的靈敏度和特異度分別為93.6%和100.0%；The ePlex?system(Carlsbad，USA)全自動多重分子診斷系統(tǒng)，結(jié)合多重PCR擴(kuò)增和數(shù)字微流控技術(shù)，可在1.5 h內(nèi)檢測41種細(xì)菌、16種真菌和10種耐藥基因(blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA、blaCTX-M、blaIMP、mecA/C和vanA/B等)，與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法比較，該檢測系統(tǒng)檢測真菌、革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的一致性分別為100.0%、97.8%和97.8%[9,20]。綜合性檢測平臺診斷性能上具有較好的優(yōu)勢，但仍需進(jìn)一步研究以獲取可靠數(shù)據(jù)，同時(shí)也需綜合考慮其臨床效益。

2 基于全血標(biāo)本的病原微生物檢測技術(shù)

從疑似BSI患者血液樣本中直接檢測病原微生物的技術(shù)，因無需進(jìn)行血培養(yǎng)而有可能顯著縮短檢測時(shí)間。已有較多基于全血標(biāo)本的快速病原微生物檢測技術(shù)，如基于PCR技術(shù)、MALDI-TOF法、宏基因組學(xué)、基于聲學(xué)分離的集成微系統(tǒng)和微芯片法、基于表面等離子體共振成像儀與抗體微陣列耦合的無標(biāo)記方法、基于微流控分離細(xì)菌方法、基于T2磁共振(T2MR)法等[3]。在這里，筆者討論最近可應(yīng)用于臨床的商業(yè)性平臺和直接從全血診斷BSI的方法。

2.1PCR技術(shù) 目前，傳統(tǒng)PCR方法以及PCR衍變的相關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)在直接檢測血液中病原菌及其耐藥基因中均有報(bào)道。同時(shí)也出現(xiàn)了較多商業(yè)性平臺或試劑盒，如LightCycler?SeptiFast Test (Roche，Germany)、SepsiTest(Molzym，Germany)、Magicplex?Sepsis Real-time Test(Seegene，Korea)和Vyoo?(Analytik Jena，Germany)等，這些均可顯著縮短檢測時(shí)間，并逐步應(yīng)用于臨床BSI診斷之中。如應(yīng)用廣泛的LightCycler?SeptiFast Test平臺，該系統(tǒng)可直接檢測全血標(biāo)本中25種病原體(10種革蘭陰性菌、9種革蘭陽性菌、6種真菌)，整個(gè)過程需4～6 h[21]。然而這些商業(yè)性平臺或試劑盒仍需經(jīng)過臨床驗(yàn)證才能進(jìn)行推廣，一項(xiàng)薈萃分析顯示，SeptiFast法與培養(yǎng)法比較，靈敏度和特異度分別為68%和86%，因此其特異度和靈敏度仍有待提高[22]。

與直接從陽性血培養(yǎng)中檢測病原微生物相比，采用PCR技術(shù)直接檢測全血標(biāo)本具有獨(dú)特的優(yōu)勢，如檢測生長緩慢及無法培養(yǎng)的微生物、處理接受過抗菌藥物治療的血樣或抽血量較少的血液樣本等。但是該方法更易造成假陽性結(jié)果，未感染時(shí)血液中存在的死細(xì)菌/真菌DNA或者有效抗感染治療后血液殘存的致病DNA等均可影響檢測。總的來說，由于檢測成本高、檢測過程標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果解釋困難、靈敏度和/或特異度有限等嚴(yán)重影響了PCR方法直接檢測BSI全血標(biāo)本的臨床應(yīng)用。

2.2PCR-電噴霧離子質(zhì)譜法(PCR ESI-MS) PCR ESI-MS通過PCR擴(kuò)增及電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將其與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以確定檢測的微生物。研究表明，該方法可直接用于全血標(biāo)本中病原微生物檢測，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的總體一致性為77.1%，靈敏度為50.0%，特異度為93.8%；而采用該方法直接檢測陽性血培養(yǎng)中病原微生物時(shí)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法總體一致性為94.2%，靈敏度為96.8%，特異度為98.5%，因此優(yōu)選用于陽性血培養(yǎng)檢測[23]。

最近，已經(jīng)開發(fā)了用于全血標(biāo)本中病原菌及耐藥基因的PCR ESI-MS檢測平臺。如雅培公司的IRIDICA系統(tǒng)允許6 h內(nèi)鑒定約800種微生物及4種耐藥基因(mecA、vanA、vanB、blaKPC)[24]。對疑似BSI患者中300份全血標(biāo)本進(jìn)行的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，采用該系統(tǒng)與常規(guī)血培養(yǎng)法總體一致性為86%，靈敏度為76%，特異度為90%[25]。由于該方法檢測結(jié)果需根據(jù)醫(yī)學(xué)圖表進(jìn)行解釋，并且無法確定抗菌藥物耐藥表型。因此，PCR ESI-MS測定應(yīng)被視為輔助而不是取代常規(guī)培養(yǎng)的方法。

2.3宏基因組學(xué) 宏基因組學(xué)是對樣本中特定或所有遺傳物質(zhì)的基因組分析。目前，對宏基因組測序主要有傳統(tǒng)的Sanger/鳥槍法和高通量測序技術(shù)(又稱二代測序技術(shù))。這些方法已成功應(yīng)用于陽性血培養(yǎng)或全血標(biāo)本中細(xì)菌鑒定，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比具有相同或更高的靈敏度[26]。一項(xiàng)多中心研究顯示，比較二代測序與常規(guī)微生物方法對101例免疫功能低下患者感染診斷價(jià)值，該方法具有更高的陰性預(yù)測值，并且可檢測到更多的臨床相關(guān)病毒和細(xì)菌[27]。此外，宏基因組學(xué)可以檢測耐藥基因和毒力基因，并提供有關(guān)分子流行病學(xué)的重要信息。

目前，基于宏基因組學(xué)方法僅開發(fā)了一種可用于血液或血液制品的商業(yè)性系統(tǒng)：The iDTECTTMDx Blood test (PathoQuest SAS，F(xiàn)rance)，該系統(tǒng)利用二代測序技術(shù)，從單個(gè)血液樣本中可識別超過1 200種臨床相關(guān)的細(xì)菌和病毒[9]。目前，由于數(shù)據(jù)庫限制、檢測樣本的高成本以及質(zhì)量控制復(fù)雜等問題阻礙了該技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的引入。

2.4基于T2磁共振(T2MR)方法 T2MR是一種微型的、基于磁共振的診斷技術(shù)。該方法主要過程包括PCR擴(kuò)增病原微生物特異度DNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到探針修飾的超順磁性納米顆粒上，最后用磁共振技術(shù)檢測。T2Candida?Panel(T2Biosystems，USA)是FDA批準(zhǔn)的基于T2磁共振檢測真菌試劑盒。該試劑盒能夠在3～5 h直接從全血中鑒定出5種念珠菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌)，無需提取DNA，最低檢測限為1 CFU/mL[28]。一項(xiàng)多中心研究顯示，采用該方法直接檢測全血標(biāo)本中病原菌的靈敏度和特異度分別為99.4%和91.1%[29]。最近，T2 Biosystems推出了T2Bacteria?Panel，能在3～5 h內(nèi)檢測引起B(yǎng)SI的6種常見細(xì)菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌)，但尚未公布任何性能數(shù)據(jù)。

3 小 結(jié)

BSI的快速病原菌鑒定和藥敏試驗(yàn)可以減少治療時(shí)間和改善患者預(yù)后。面對日益嚴(yán)峻的抗菌藥物耐藥性威脅，能夠在幾小時(shí)內(nèi)確定BSI病原菌的快速診斷方法，有望成為BSI治療及抗菌藥物管理最有效的方法。目前，大多數(shù)方法依賴于陽性血培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)菌鑒定，但仍為一些不可培養(yǎng)的病原菌留下檢測缺口。而直接從患者血液進(jìn)行檢測病原菌的方法可能對顯著縮短BSI診斷周轉(zhuǎn)時(shí)間更有潛力，但其檢測的靈敏度和特異度仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。隨著對各種新技術(shù)研究的深入，一些技術(shù)逐漸從研究階段應(yīng)用于臨床，但理想的BSI病原微生物檢測技術(shù)不僅應(yīng)該能快速確定病原菌，更重要的是確定其抗菌藥物靈敏度信息。迄今為止對抗菌藥物靈敏度的測定仍然取決于對分離菌株的藥敏分析，因此能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定BSI病原菌及同步獲得藥敏信息的新方法仍需不斷探索。