表面活性劑對(duì)表面等離子體共振分析的影響

李 輝, 李桂瀾, 董 志

(北京大學(xué) 生命科學(xué)公共儀器中心, 北京 100871)

表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)能夠檢測(cè)距離傳感芯片表面約100 nm范圍內(nèi)分子結(jié)合和解離導(dǎo)致的折射率的變化,從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用。為了研究分子之間的相互作用,讓一種分子固定在芯片上,而另一種分子的溶液流過(guò)芯片表面,如果有相互作用,則芯片表面附近的質(zhì)量變化導(dǎo)致表面等離子體共振響應(yīng)值的變化,從而分析出兩種物質(zhì)相互作用的快慢和強(qiáng)弱[1]。

利用表面等離子體共振技術(shù)分析分子之間相互作用的過(guò)程中,通常會(huì)在運(yùn)行緩沖液中添加非離子型表面活性劑,以盡量減少蛋白質(zhì)和其他生物分子在流動(dòng)系統(tǒng)包括芯片表面以及液體流經(jīng)的管路中發(fā)生沉淀及吸附的可能。有文獻(xiàn)報(bào)道在特定的條件下,接近臨界膠束濃度的表面活性劑有助于保持蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[2],各種方法被用于研究表面活性劑防止蛋白沉淀或團(tuán)聚的機(jī)理[3-5],但是不同的蛋白與表面活性劑的作用方式不同,表面活性劑防止蛋白沉淀或團(tuán)聚的機(jī)理也并不明確[6]。

表面活性劑是指加入少量能使溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質(zhì)。表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性：一端為親水基團(tuán),另一端為疏水基團(tuán)。根據(jù)表面活性劑在水溶液中是否電離,可以把表面活性劑分為離子型表面活性劑(包括陽(yáng)離子表面活性劑與陰離子表面活性劑)、非離子型表面活性劑、兩性表面活性劑、復(fù)配表面活性劑、其他表面活性劑等。非離子型表面活性劑的親水基團(tuán)主要由一定數(shù)量的含氧基團(tuán)(一般為醚基和羥基) 構(gòu)成,在水溶液中不電離因此穩(wěn)定性高,不易受強(qiáng)電解質(zhì)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)存在的影響,也不易受pH值的影響,比較適合應(yīng)用于生物反應(yīng)體系。

商業(yè)化的表面等離子體共振分析儀配套的運(yùn)行緩沖液中添加的表面活性劑為聚山梨醇20(polysorbate20,P20)。對(duì)于P20的性質(zhì)以及添加P20對(duì)于分子間相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何種影響并沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本文利用等溫滴定量熱儀對(duì)P20的性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

表面等離子體共振分析儀BIACORE T200、CM5芯片、N-乙基-N′-(3-二氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶液、0.1mol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液、10×PBS緩沖液(27 mmol/L KCl,1.37 mol/L NaCl)以及surfactant P20均購(gòu)自美國(guó)通用電氣公司。等溫滴定量熱儀ITC200購(gòu)自英國(guó)馬爾文儀器有限公司。蛋白(分子量70 ku)及與之相互作用的多肽(1 ku)為用戶提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 臨界膠束濃度的確定

配置含有不同濃度表面活性劑P20的1×PBS-P緩沖液,用其滴定1×PBS緩沖液,滴定速率為0.5 μL/s,間隔120 s,轉(zhuǎn)速為1 000 r/min,滴定溫度為25℃。數(shù)據(jù)分析采用MicroCal ORIGIN 軟件。

2.2 配體在芯片表面的固定

配體在芯片表面的固定采用氨基偶聯(lián)的方式[7]。將芯片裝入儀器中,以10 μL/min的流速通入0.4 mol/L N-乙基-N′-(3-二氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶液和0.1 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液的混合溶液(體積比為1∶1),活化芯片表面(1通道及2通道)7 min。芯片表面活化后,將配體(蛋白)用10 mmol/L醋酸緩沖液(pH4.5)稀釋至20 μg/mL,以10 μL/min的流速注入芯片表面2通道中,達(dá)到所需的固定量后,將1 mol/L乙醇胺以10 μL/min的流速注入芯片表面(1通道及2通道)7 min,滅活剩余的酯鍵。所有反應(yīng)均在25 ℃的條件下進(jìn)行。

2.3 分子間相互作用分析

將含有0.05%的P20的1×PBS-P緩沖液作為運(yùn)行緩沖液,并將分析物(多肽)用1×PBS-P稀釋成不同濃度后通入芯片表面。利用不含P20的1×PBS緩沖液重復(fù)上述試驗(yàn)。數(shù)據(jù)記錄及分析所用軟件分別為Biacore T200 Control software 以及Biacore T200 Evaluation software。

3 結(jié)果與討論

3.1 表面活性劑P20臨界膠束濃度的測(cè)定

等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry, ITC)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種研究生物熱力學(xué)的重要方法。利用高靈敏度、高自動(dòng)化的微量熱儀連續(xù)監(jiān)測(cè)和記錄微量分析物溶液滴加至一定體積的配體溶液中產(chǎn)生的熱量變化,同時(shí)提供結(jié)合平衡常數(shù)(KA)、化學(xué)計(jì)量比(n)、焓變(ΔH)和熵變(ΔS)等多方面的信息。研究表面活性劑分子的性質(zhì)、團(tuán)聚的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)、臨界膠束濃度等是等溫滴定量熱技術(shù)的一個(gè)重要的應(yīng)用領(lǐng)域[8-11]。研究[11]表明,利用等溫滴定量熱儀測(cè)量離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的臨界膠束濃度得到的滴定曲線為“S”型曲線,每次滴加SDS溶液產(chǎn)生的焓變?chǔ)ilH,以及滴加過(guò)程完成后的濃度SDS的關(guān)系可以用式(1)進(jìn)行描述[11],式中a1—a5為擬合參數(shù)。滴定曲線的拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度即為臨界膠束濃度。

(1)

本文利用等溫滴定量熱儀對(duì)P20的性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1(Q為熱量，負(fù)號(hào)表示放熱)。

圖1 利用含有2% P20的PBS緩沖液滴定不含有P20的PBS緩沖液所得的滴定曲線和不同濃度P20的PBS緩沖液滴定不含有P20的PBS緩沖液的放熱量與滴數(shù)之間的關(guān)系

結(jié)果表明，P20在25 ℃的條件下在PBS緩沖液中的稀釋過(guò)程為放熱過(guò)程,與上述文獻(xiàn)中報(bào)道的SDS的滴定曲線不同,并非典型的“S”型曲線,而是與膽汁鹽類(lèi)表面活性劑的滴定曲線[8]較為類(lèi)似,滴定產(chǎn)生的焓變并沒(méi)有出現(xiàn)跳躍性突變并導(dǎo)致滴定曲線出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn),因此不能準(zhǔn)確地測(cè)定臨界膠束濃度。由此可以推斷P20作為一種非離子型表面活性劑,即使在很高的濃度下依然可以均勻分布在緩沖液中,不發(fā)生明顯的聚集或是形成大的膠束。

從P20的分子結(jié)構(gòu)(圖2)看,P20含有20個(gè)氧乙烯單元,但是這20個(gè)氧乙烯單元在分子不同側(cè)鏈上的分布數(shù)目并不固定,因此P20可以看作多種分子的混合物,可能沒(méi)有確定的臨界膠束濃度。

3.2 添加表面活性劑P20對(duì)表面等離子體共振分析的影響

正常情況下,利用表面等離子體共振技術(shù)進(jìn)行分子間相互作用分析實(shí)驗(yàn)得到的傳感曲線對(duì)應(yīng)分子結(jié)合過(guò)程的部分應(yīng)為指數(shù)上升曲線,解離部分應(yīng)為指數(shù)下降曲線[12]。

圖3(a)為利用1×PBS作為運(yùn)行緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的傳感曲線(2通道響應(yīng)值扣減1通道響應(yīng)值)，不同顏色表示不同濃度。從圖中可以看出,傳感曲線形狀并非正常的指數(shù)上升曲線。在0 s注入樣品后,曲線迅速上升至大約9后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),然后又逐漸上升,形狀為“凹”線。圖3(b)為利用1×PBS-P作為運(yùn)行緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的傳感曲線(2通道響應(yīng)值扣減1通道響應(yīng)值)。0 s注入樣品后傳感曲線為比較正常的指數(shù)上升曲線。由圖3結(jié)果可以看出,運(yùn)行緩沖液中不添加表面活性劑P20無(wú)法得到正常的傳感曲線。

圖2 聚山梨醇20的分子結(jié)構(gòu)

圖3 利用PBS和PBS-P作為運(yùn)行緩沖液所得傳感曲線

為了進(jìn)一步分析不添加表面活性劑P20無(wú)法得到正常的傳感曲線的原因,對(duì)圖3中兩組傳感曲線的參比通道(1通道)以及反應(yīng)通道(2通道)信號(hào)進(jìn)行了對(duì)比分析。

在參比表面由于沒(méi)有固定配體,不發(fā)生結(jié)合反應(yīng),因此通入樣品后得到的相對(duì)響應(yīng)值來(lái)源于樣品與運(yùn)行緩沖液之間的折射率差異以及非特異吸附。在無(wú)法得到正常的傳感曲線時(shí),通常需要對(duì)參比通道的信號(hào)進(jìn)行分析,以便得到樣品的濃度、非特異吸附等方面的信息。圖 4(a)為將25 mmol/L樣品通入芯片表面進(jìn)行測(cè)試,在參比通道(1通道)得到的傳感曲線。從圖中可以看出,在樣品及運(yùn)行緩沖液中沒(méi)有添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品產(chǎn)生的相對(duì)響應(yīng)值(綠線)大約為110。添加P20后通入樣品后產(chǎn)生的相對(duì)響應(yīng)值(紅線)為280。添加P20后1通道的相對(duì)響應(yīng)值顯著增加?？赡艿脑颍翰惶砑颖砻婊钚詣㏄20,樣品在管路中的非特異吸附量增加,導(dǎo)致流過(guò)芯片表面的樣品的實(shí)際濃度低于配制的濃度,因此流過(guò)芯片表面的樣品與運(yùn)行緩沖液的折射率差值減少。

將圖4(a)兩條傳感曲線按照結(jié)合點(diǎn)對(duì)齊的方式對(duì)y軸進(jìn)行調(diào)整后得到圖4(b)圖。從圖4(b)中可以看出,在樣品及運(yùn)行緩沖液中沒(méi)有添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品后,參比通道的傳感曲線(綠線)有一個(gè)持續(xù)緩慢上升的過(guò)程。添加P20后,參比通道的傳感曲線(紅線)在注入點(diǎn)之后迅速達(dá)到最高點(diǎn)后并保持一定高度,無(wú)明顯上升趨勢(shì)。產(chǎn)生這種差異的原因可能是：(1)不添加表面活性劑P20,樣品中的分子持續(xù)不斷地吸附在芯片的表面的參比通道上,從而產(chǎn)生緩慢上升的信號(hào);(2)不添加表面活性劑P20,樣品在管壁上的非特異吸附造成樣品不均一,首先接觸芯片表面的樣品濃度低于后來(lái)接觸芯片表面的樣品濃度，隨著時(shí)間的推移,樣品中的濃度逐漸增加至配制濃度；而添加表面活性劑P20之后,樣品在管道中以及芯片表面的非特異吸附都有所減少,樣品均一度提高。

圖5(a)為通入25 mmol/L樣品進(jìn)行測(cè)試,在反應(yīng)通道(2通道)得到的傳感曲線。從圖中可以看出,在樣品及運(yùn)行緩沖液中不添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品產(chǎn)生的相對(duì)響應(yīng)值(綠線)大約為110。在樣品及運(yùn)行緩沖液中添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品后產(chǎn)生的相對(duì)響應(yīng)值為350,添加表面活性劑P20提高了2通道的相對(duì)響應(yīng)值,與1通道情況類(lèi)似。與1通道不同的是,不添加表面活性劑P20,反應(yīng)通道的傳感曲線在注入點(diǎn)之后迅速達(dá)到最高點(diǎn)后并保持一定高度,無(wú)明顯上升趨勢(shì)。添加表面活性劑P20,反應(yīng)通道的傳感曲線在注入點(diǎn)之后達(dá)到最高點(diǎn)后有一個(gè)持續(xù)上升的過(guò)程。

圖4 通入25 mmol/L樣品進(jìn)行測(cè)試,在參比通道(1通道)得到的傳感曲線(綠線對(duì)應(yīng)的運(yùn)行緩沖液為PBS，紅線對(duì)應(yīng)的運(yùn)行緩沖液為PBS-P和將(a)圖按照結(jié)合點(diǎn)對(duì)齊的方式對(duì)y軸進(jìn)行調(diào)整后所得傳感曲線(1通道)

圖5 通入25 mmol/L樣品進(jìn)行測(cè)試,在反應(yīng)通道(2通道)得到的傳感曲線(綠線對(duì)應(yīng)的運(yùn)行緩沖液為PBS,紅線對(duì)應(yīng)的運(yùn)行緩沖液為PBS-P)和按照結(jié)合點(diǎn)對(duì)齊的方式對(duì)y軸進(jìn)行調(diào)整后所得傳感曲線(2通道)

圖5(b)為按照結(jié)合點(diǎn)對(duì)齊方式對(duì)y軸進(jìn)行調(diào)整后所得傳感曲線，紅線扣減圖4(a)紅線為利用PBS-P進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的最終傳感曲線,為正常的指數(shù)上升曲線。圖5(b)綠線扣減圖4(b)圖綠線為利用PBS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的最終傳感曲線,為“凹線”。由此可以看出,添加P20減少了非特異性吸附,增強(qiáng)了特異性吸附,使得傳感曲線由“凹線”變?yōu)檎５闹笖?shù)上升曲線。

4 結(jié)語(yǔ)

在運(yùn)行緩沖液及樣品中添加表面活性劑P20,可以減少樣品在流通系統(tǒng)中的非特異吸附,防止待測(cè)樣品的實(shí)際濃度低于配制濃度,提高特異性結(jié)合水平。在一些應(yīng)用中,特別是那些涉及脂類(lèi)囊泡和疏水性蛋白的應(yīng)用中,緩沖液中不使用表面活性劑[1],可能是為了避免表面活性劑與脂類(lèi)囊泡和疏水性蛋白的相互作。在這類(lèi)實(shí)驗(yàn)中如何避免樣品在流通系統(tǒng)及芯片表面的非特異吸附需要進(jìn)一步的研究。