亮氨酸對(duì)早期斷奶湖羊瘤胃發(fā)育及細(xì)菌菌群的影響

孫施杰，王 羽中，茅慧玲

（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安 311300）

早期斷奶可促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育、滿足補(bǔ)償性生長(zhǎng)以及提高母羊的繁殖率等[1-2]。然而早期斷奶時(shí)羔羊易出現(xiàn)“應(yīng)激綜合征”，尤其是胃腸道的氧化應(yīng)激會(huì)使羔羊出現(xiàn)“生長(zhǎng)性休克”或負(fù)增長(zhǎng)，導(dǎo)致成活率和育成率降低。亮氨酸作為動(dòng)物的必需氨基酸，除參與哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)合成和骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)、腸道發(fā)育調(diào)節(jié)外[3-5]，還是一種有效的抗氧化物質(zhì)，可以有效緩解氧化應(yīng)激，維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡[6]。胡軍等[7]研究報(bào)道，添加亮氨酸可以降低早期斷奶仔豬腸道的活性氧水平。因此推測(cè)，新生羔羊補(bǔ)飼亮氨酸可促進(jìn)瘤胃的早期發(fā)育，促進(jìn)瘤胃微生物區(qū)系的建立，減緩早期斷奶應(yīng)激引起的氧化損傷，從而提高生產(chǎn)性能。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)探討亮氨酸對(duì)早期斷奶湖羊羔羊瘤胃細(xì)菌菌群組成以及瘤胃發(fā)酵的影響，從瘤胃微生物角度研究亮氨酸對(duì)瘤胃發(fā)育影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取出生5 d 健康無(wú)疾病的湖羊羔羊36只，根據(jù)體重、出生日期相同或相近的原則，按照亮氨酸的添加量不同隨機(jī)分為對(duì)照組（C，0 g/d）、低劑量添加組（L，0.66 g/d）和高劑量添加組（H，1.33 g/d），每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 只羔羊。羔羊飼喂代乳粉，每天飼喂3 次，自由采食；經(jīng)5 d 適應(yīng)環(huán)境和代乳粉后，于10 日齡開始正式試驗(yàn)，飼喂代乳粉的同時(shí)補(bǔ)喂開食料及羊草。代乳粉的飼喂量為每天780 mL/ 只（根據(jù)適應(yīng)期代乳粉的采食量確定），為促進(jìn)開食料和羊草的采食，代乳粉每天減少30 mL/ 只至210 mL/ 只時(shí)，維持此飼喂量不變直至30 日齡斷奶。亮氨酸溶解在70 mL代乳粉中，于每天晨飼時(shí)通過(guò)灌喂的方式添加1次。

羔羊在30 日齡斷奶當(dāng)天，根據(jù)平均體重和平均日采食量每個(gè)重復(fù)取1 只羔羊進(jìn)行屠宰。在瘤胃顱腹囊的中心采集1 m3左右的瘤胃組織樣品，保存在30% 的福爾馬林溶液中。瘤胃內(nèi)容物部分保存于-20 ，用于測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù)，另一部分保存于-80 ，用于提取DNA，測(cè)定瘤胃細(xì)菌的多樣性。

表1 代乳粉、開食料及羊草營(yíng)養(yǎng)成分① %

1.2 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)日糧由代乳粉、開食料（杭州思我特農(nóng)業(yè)科技有限公司）和羊草組成，其營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 瘤胃組織形態(tài) 瘤胃組織樣品采用酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100% 酒精脫水30 min，100% 酒精脫水15 min），脫水后組織轉(zhuǎn)移至二甲苯透明2 h 后石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法。光學(xué)顯微鏡（Leica，美國(guó)）下的每張切片隨機(jī)選10 個(gè)典型視野，使用Motic Image Plus 2.0 軟件（廈門，中國(guó)）測(cè)定瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度。

1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）：采用氣相色譜法測(cè)定瘤胃內(nèi)容物VFA 濃度。取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS 中震蕩懸浮洗滌，13 000×g 4 離心15 min，取上清液，每1 mL VFA 樣品中加入20 μL 85%～90% 正磷酸，按照上述方法再次離心，取上清液，采用氣相色譜（GC-8A；島津公司，京都，日本）測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸的濃度，進(jìn)樣量為2 μL，注射器/ 檢測(cè)器的溫度為260 ，柱溫為220 ，載氣為高純氮[8]。

氨態(tài)氮（NH3-N）濃度：取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS 中震蕩懸浮洗滌，取5 mL 于3 500～4 000 r/min 離心10 min，取上清，采用馮宗慈等[9]方法，使用氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品，用酶標(biāo)儀測(cè)定700 nm 波長(zhǎng)條件下上清中NH3-N 濃度。

微生物蛋白：取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS中震蕩懸浮洗滌，取8 mL，4 20 000×g 離心20 min，去上清。采用嘌呤法，以酵母RNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用紫外分光光度計(jì)（Beckman，DU 640）測(cè)定在260 nm波長(zhǎng)條件下微生物蛋白含量。

1.3.3 瘤胃細(xì)菌多樣性

1.3.3.1 DNA 提 取 參 照 Gagen 等[10]的 珠 磨 法 提 取DNA。所有DNA樣品用Qubit2.0（Invitrogen）測(cè)定濃度。

1.3.3.2 細(xì)菌16S rRNA 基因序列擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列擴(kuò)增采用341F/806R 通用引物[11]：上游為5'-ACTCCTA CGGGRSGCAGCAG-3'；下游為 5'-GGACTACVVGGGTA TCTAATC-3'。為區(qū)分每個(gè)不同的樣本，在通用引物的上游序列中隨機(jī)添加8 個(gè)核苷酸堿基的序列標(biāo)簽，即Barcoded-tag，形成Barcoded 融合引物。PCR 反應(yīng)條件：95 預(yù)變性 5 min；95 變性 40 s，55 退火 40 s，72 延伸 1 min，共 30 循環(huán)；72 延伸 7 min。

1.3.3.3 Illumina HiSeq 測(cè)序及下機(jī)數(shù)據(jù)分析 Illumina-HiSeq 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析委托上海銳翌生物科技有限公司完成。測(cè)序后首先對(duì)原始數(shù)據(jù)拼接（PANDAseq 軟件）和質(zhì)控（去除平均質(zhì)量低于20 的reads，去除reads含N 堿基數(shù)超過(guò)3 個(gè)的reads）得到Clean reads；采用Usearch軟件在97% 相似度下進(jìn)行聚類以及嵌合體過(guò)濾從而得到OTU；對(duì)每個(gè)樣品的Reads 進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，并提取對(duì)應(yīng)的OTU 序列；采用Qiime 軟件做Alpha 多樣性指數(shù)的稀釋曲線，根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù)；從Qiime 軟件分析抽平后的OTU 中分別提取1條Read 作為代表序列，使用RDP 方法，將該代表序列與16S 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)每個(gè)OTU 進(jìn)行物種分類；歸類后，根據(jù)每個(gè)OTU 中序列的條數(shù)，得到OTU 豐度表，最后根據(jù)該OTU 豐度表進(jìn)行后續(xù)分析。微生物各門屬和OTU 需在每個(gè)處理組的至少3 只羔羊中出現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SAS 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，正交多項(xiàng)式比較不同水平亮氨酸的作用（線性或二次），差異顯著時(shí)用Duncan's 作多重比較。以P≤0.01 表示為差異極顯著，P≤0.05 表示為差異顯著，以 0.05＜P≤0.10 表示差異有趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響 由圖1 可見，日糧添加亮氨酸可以增加羔羊瘤胃乳頭的長(zhǎng)度。由表2 可見，瘤胃乳頭長(zhǎng)度隨著亮氨酸添加量的增加而增加，且在C 組與H 組達(dá)顯著水平（線性，P＜0.01）；添加亮氨酸可使瘤胃乳頭寬度有增加趨勢(shì)，但3 組間無(wú)顯著差異（線性，P＞0.05）。

2.2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2 可見，亮氨酸可使瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）水平顯著提高（二次，P=0.05），但未改變乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比例（P＞0.05）。與C 組相比，L 與H 組的瘤胃NH3-N 濃度均顯著降低（線性，P＜0.05；二次，P＞0.05）， 分別降低 43.0% 和 36.7%， 且 L 組羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物蛋白濃度顯著高于C 組（二次，P=0.05）。

2.3 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃微生物多樣性的影響

表2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃組織發(fā)育及發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3.1 微生物多樣性分析 下機(jī)序列經(jīng)拼接、優(yōu)化、質(zhì)控后共得到566 213 條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個(gè)樣品47 184條（±4 391 條）。共獲得343 個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品148 個(gè)（±22 個(gè)）。樣品稀釋曲線如圖2 所示，Good's coverage 在0.99 以上，因此，本試驗(yàn)測(cè)序深度能夠準(zhǔn)確反映湖羊瘤胃微生物組成。

由表3 可見，3 組羔羊瘤胃內(nèi)容物的OTU 個(gè)數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

由圖 3 可見，3 組 OTU 數(shù)共有 164 個(gè)，C、L 和H組特有的OTU 數(shù)分別為24、29、43 個(gè)。

2.3.2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃物種分類的影響 瘤胃細(xì)菌門分類圖顯示（圖4），瘤胃內(nèi)細(xì)菌主要?dú)w于厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria） 和變形菌門（Proteobacteria）四大類。3 個(gè)處理組瘤胃內(nèi)微生物種類存在差異（表4），L 組瘤胃內(nèi)最多的是厚壁菌門（49.5%），H 組擬桿菌門（51.4%）顯著高于L、C 組（二次，P=0.05）。

表3 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)

表4 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物門水平（＞0.1%）相對(duì)豐度

由表5 可知，各組均以普雷沃氏菌屬、歐陸森氏菌屬、小桿菌屬和瘤胃球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且普雷沃氏菌占比例最多。H 組的普雷沃氏菌屬最多，達(dá)41.4%；與C 組相比，L 組的雙歧桿菌屬（ 二次，P＜0.05）、光崗菌屬（二次，P＜0.05）和巨型球菌屬顯著增加（二次，P＜0.01）；梭菌屬隨著亮氨酸的添加而降低，且在C 組與H 組達(dá)顯著水平（線性，P＜0.05）。各組間歐陸森氏菌屬、擬桿菌屬、纖維桿菌屬、小桿菌屬、瘤胃球菌屬、琥珀酸菌屬等相對(duì)含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

瘤胃上皮約有25 萬(wàn)個(gè)瘤胃乳頭，可使黏膜表面積擴(kuò)大6～7 倍，從而通過(guò)增加瘤胃上皮與瘤胃內(nèi)容物的接觸面積來(lái)增加瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。因此可通過(guò)瘤胃乳頭的發(fā)育狀況（長(zhǎng)度和寬度）來(lái)衡量瘤胃發(fā)育狀況[13]，而瘤胃微生物發(fā)酵固體飼料產(chǎn)生的VFA 是刺激瘤胃乳頭發(fā)育的主要原因[14]。本研究顯示，添加亮氨酸雖然對(duì)乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比沒(méi)有影響，但可顯著增加TVFA 濃度，這部分結(jié)果與添加亮氨酸增加瘤胃乳頭長(zhǎng)度的結(jié)果較為一致。亮氨酸增加TVFA 的主要原因與開食料采食量（123 g/d vs131 g/d vs 95.2 g/d，未發(fā)表數(shù)據(jù)）的變化有關(guān)。另一方面，L組羔羊消化道和瘤胃的重量與C 組相比分別提高47.4%和38.6%（未發(fā)表數(shù)據(jù)），表明添加適量亮氨酸可促進(jìn)羔羊消化道和瘤胃的發(fā)育，有利于營(yíng)養(yǎng)吸收。

表5 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物屬水平（＞ 0.1%）相對(duì)豐度

瘤胃液中的NH3-N 是瘤胃氮代謝過(guò)程中內(nèi)源含氮物質(zhì)和外源蛋白質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料。一般情況下，瘤胃NH3-N 水平呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但影響瘤胃NH3-N濃度的因素較多，主要包括飼料蛋白的降解程度、氮的攝入量、瘤胃對(duì)NH3-N 的吸收以及瘤胃微生物合成微生物蛋白的速度。本研究發(fā)現(xiàn)，添加亮氨酸可以降低瘤胃NH3-N 濃度，增加瘤胃微生物蛋白含量。推測(cè)可能的原因是亮氨酸作為一種氨基酸可以促進(jìn)瘤胃內(nèi)蛋白分解菌的生長(zhǎng)，從而提高瘤胃細(xì)菌對(duì)含氮物質(zhì)的降解，提高菌體蛋白合成的底物水平，最終增加瘤胃微生物蛋白的含量。后續(xù)可通過(guò)測(cè)定瘤胃蛋白分解菌的變化驗(yàn)證這一推論。

腸道菌群主要由厚壁菌門（35%～80%）和擬桿菌門（17%～60%）構(gòu)成[15]。本試驗(yàn)中厚壁菌門和擬桿菌門是各組羔羊瘤胃細(xì)菌豐度最高的菌群，與前人的研究結(jié)果較為一致。普雷沃氏菌屬是瘤胃內(nèi)容物中豐度最高的菌屬[16]，該菌屬是含有豐富高效的水解淀粉和蛋白質(zhì)的菌種[17]。雙歧桿菌屬是糖類分解菌[18]，尤其在飼喂高淀粉日糧的瘤胃中大量存在。因此，普雷沃氏菌屬和雙歧桿菌屬相對(duì)豐度變化受采食量的影響較大，然而L組普雷沃氏菌屬豐度較H 組顯著降低，這一結(jié)果與固體開食料采食量呈相反趨勢(shì)，說(shuō)明在本試驗(yàn)中亮氨酸對(duì)普雷沃氏菌屬豐度的影響并非取決于飼料的攝入量，具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。巨型球菌屬中的埃氏巨型球菌是瘤胃中提供支鏈VFA 的重要來(lái)源[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，在新生奶牛日糧中補(bǔ)飼埃氏巨型球菌NCIMB41125 能夠提高犢牛的生長(zhǎng)性能，增加瘤胃內(nèi)丁酸濃度、瘤胃上皮乳頭寬度和密度，表明埃氏巨型球菌NCIMB41125 能通過(guò)促進(jìn)瘤胃代謝、增加代謝產(chǎn)物的吸收來(lái)促進(jìn)瘤胃的發(fā)育[20]。因此，瘤胃埃氏球菌屬相對(duì)豐度的增加在瘤胃發(fā)育中可能起重要作用。光崗菌屬具有很強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力[21]，其終產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸。添加低劑量的亮氨酸可以增加該菌屬的豐度，但是高劑量反而沒(méi)有顯著影響，原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，灌喂亮氨酸對(duì)早期斷奶羔羊的瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性沒(méi)有影響，但可以改變細(xì)菌組成（如瘤胃埃氏球菌屬和光崗菌屬的相對(duì)豐度增加），從而影響瘤胃發(fā)酵，增加羔羊瘤胃TVFA 含量，降低NH3-N 濃度，提高微生物蛋白濃度，促進(jìn)瘤胃的發(fā)育，減少斷奶應(yīng)激，且亮氨酸添加量以0.66 g/d 效果更為顯著。