黑豆皮中原花青素含量測定及抗氧化活性研究

李 勇，李代魁，李忠平，董 川

（山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西太原 030006）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，簡稱PC） 是重要的一類植物次生代謝產(chǎn)物，最早是從松樹皮中提取出來的，隨后陸續(xù)從葡萄、蘋果、山楂、蓮蓬、銀杏、可可、柳樹葉、白樺樹等植物的皮、核或種子中發(fā)現(xiàn)了原花青素[1]。原花青素是一類自然發(fā)生的黃烷醇聚合而成的多酚類物質(zhì)，按聚合度的大小將二至四聚體統(tǒng)稱為低聚體（OPC），將五聚體及其以上的縮合體統(tǒng)稱為高聚體（PPC）[2]。在所有類型的原花青素里，二聚體來源最廣，對其的研究也最多[3]。原花青素具有豐富的藥理活性，根據(jù)文獻(xiàn)報道[4-8]，PC具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)的作用。因此，PC在化妝品、營養(yǎng)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域越來越受到人們的青睞。

我國自古以來就有“大豆數(shù)種，唯黑入藥”的歷史記載，黑豆皮在我國古代中藥中具有重要的藥用地位[9]。對黑豆皮及子葉中的物質(zhì)組分進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，黑豆皮中的多酚類物質(zhì)含量較高，特別是花青素和原花青素等化學(xué)物質(zhì)[10-11]。黑豆是一種集食用、保健、藥用于一體的豆類品種，但其中的原花青素的提取與測定方法文獻(xiàn)報道較少。因此，試驗(yàn)選取黑豆皮為原材料，以乙醇為提取劑，提取和純化原花青素，并建立原花青素的HPLC分析方法，旨在確定快速、準(zhǔn)確、可靠的分離分析黑豆皮中PC的方法，同時為黑豆皮的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)，為黑豆皮的深加工工業(yè)化生產(chǎn)提供可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆皮，購于太原市某農(nóng)貿(mào)市場。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），上海哈靈生物科技有限公司提供；乙醇、甲醇、鹽酸，均為分析純；HPLC甲醇為色譜級、ABTS（2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），Aladdin公司提供。

電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；超聲波清洗器，天鵬電子新技術(shù)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph/G3）、紫外-可見分光光度計，珀金埃爾默儀器上海有限公司產(chǎn)品；安捷倫HPLC-1200型高效液相色譜儀。

原花青素對照品見圖1。

圖1 原花青素對照品

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取2.00 mg原花青素溶于2.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸甲醇溶液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲備液中吸取一定量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸水溶液稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5，50，100，250，500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品待測液，用0.45 μm濾膜過濾，取20 μL上樣。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取黑豆皮樣品各20 g，加入200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇，于室溫下超聲處理3次，每次15 min；采用布氏漏斗過濾，得濾液。濾渣再用200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸的乙醇溶液重復(fù)提取2次，將3次濾液合并，于40℃下真空濃縮去除乙醇，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸的去離子水定容至10 mL備用。

將上述提取液經(jīng)Sepabeads SP700型大孔樹脂柱分離，去除提取物可能含有的脂溶性成分、非極性糖類成分、有機(jī)酸類。用水，體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，60%，90%的乙醇水溶液各200 mL分別洗脫粗提物，用5個錐形瓶分別接取洗脫液，分別經(jīng)過旋蒸儀減壓濃縮后，用色譜純甲醇或去離子水溶解濃縮產(chǎn)物，用色譜甲醇定容至5 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液I，II，III，IV，Ⅴ于冰箱中冷藏。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，四元泵；流動相A為水（含2%冰醋酸水溶液），流動相B為甲醇；流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，檢測波長280 nm。梯度條件：0～25 min，10%～30%B；25～32 min， 30%-80%B； 32～50 min，80% ～100%B；50～60 min，100%B；60～61min，100%～10%B。

1.2.4 ABTS法

使用ABTS法測抗氧化性，在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[12]稍加修飾。取10 μL的樣品溶液加入2 mL ABTS+溶液避光反應(yīng)2 min，空白試驗(yàn)加入2 mL水反應(yīng)2 min。

ABTS+溶液的配置：用天平稱取54.8 g ABTS+溶于20 mL磷酸鹽緩沖液（pH值7.0），加入1 g的MnO2，活化20 min。取2 mL活化好的溶液離心，用磷酸緩沖溶液稀釋上清液，使其A734（t0）=0.800±0.02 nm。然后于734 nm處測量吸光度。以維C作為對照，計算IC50值。

依據(jù)以下公式，可以計算出ABTS+的清除率：

式中：A0——空白溶液的吸光度值；

At——樣品與ABTS+反應(yīng)后的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的專屬性

對于樣品I，II，III，IV，V和標(biāo)準(zhǔn)品待測液進(jìn)行HPLC測定，發(fā)現(xiàn)IV和標(biāo)準(zhǔn)品待測液在47.3 min左右的時間內(nèi)出峰，再在IV樣品中加入了適量的標(biāo)準(zhǔn)品待測液，對其進(jìn)行HPLC測定，發(fā)現(xiàn)峰面積明顯變大，確定IV樣品中含有原花青素，而其他樣品中未檢測出明顯的目標(biāo)峰。以30%乙醇水洗脫得到的組分色譜圖為例，如圖2所示。

30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖見圖2。

圖2 30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖

由圖2可見，30%乙醇水溶液洗脫得到的組分色譜圖中，在47.3 min附近無明顯的色譜峰，因此不采用這一洗脫液的組分進(jìn)行黑豆皮原花青素的含量分析，同理，在水、10%乙醇水、90%乙醇水中均未檢測出明顯的目標(biāo)峰，因此都被排除，而采用60%乙醇水作為樹脂柱洗脫液得到的組分來進(jìn)行原花青素的含量分析，其他洗脫液的目的在于分離無關(guān)雜質(zhì)，方便HPLC分析。

原花青素對照品、樣品I、樣品I+對照品色譜圖見圖3。

圖3 原花青素對照品、樣品I、樣品I+對照品色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

取適量的原花青素標(biāo)品，對其進(jìn)行紫外掃描，從得到的圖形中可以看出原花青素在280 nm左右的地方有最大吸收，280 nm處為其特征吸收，所以確定280 nm作為高效色譜的檢測波長。

原花青素對照品的紫外圖譜見圖4。

2.3 線性關(guān)系與檢測限

由1.2.1配置的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.2.3的色譜條件下，經(jīng)高效液相色譜儀測得原花青素的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積，結(jié)果表明PC在5～500 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3.578 9X-41.036，R2=0.980 5，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。經(jīng)HPLC測定，當(dāng)PC峰高為儀器響應(yīng)噪聲的3倍量時，檢測限為1 000 ng （S/N=3）。

圖4 原花青素對照品的紫外圖譜

PC標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 PC標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品待測液，連續(xù)進(jìn)樣5次HPLC測定，計算其峰面積，RSD為3.72%，儀器具有良好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取I號樣品分別于0，2，4，8，12 h各進(jìn)樣一次HPLC測定，計算其峰面積，RSD為3.70%，證明在12 h內(nèi)樣品的穩(wěn)定性可以得到保證。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取黑豆皮樣品5份，每份都是20 g，重復(fù)進(jìn)行樣品的制備工作，對5次制備所得的I號樣品各進(jìn)行1次HPLC測定，計算其峰面積，RSD為2.26%，表明了該試驗(yàn)具良好的重現(xiàn)性。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取上述已經(jīng)測得原花青素含量的I號樣品共1.5 mL，平均分配到1，2，3號小瓶中，再用質(zhì)量濃度100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品待測液定容至1 mL，分別上樣進(jìn)行HPLC 測定，計算得到回收率分別為106.13%，95.85%，102.30%，平均回收率101.43%，RSD為1.46%，結(jié)果顯示該試驗(yàn)回收率良好。

2.8 樣品含量測定

精密稱取黑豆皮樣品5份，每份都是20 g，按1.2.2節(jié)樣品處理方法制備，測定各供試品溶液的峰面積，計算原花青素的含量。

黑豆皮PC含量的測定見表1。

2.9 ABTS+的清除能力比較

黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力見圖6。

表1 黑豆皮PC含量的測定（n=5）

圖6 黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力

通過測定某物質(zhì)清除自由基的能力，即可表征其抗氧化活性強(qiáng)弱[11]。圖6顯示了黑豆皮中原花青素提取物對于ABTS+的清除效果明顯，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，即其抗氧化活性與質(zhì)量濃度間存在量效關(guān)系。半抑制量（IC50）為13.62 μg/mL，遠(yuǎn)小于陽性對照維C 98.23 μg/mL。

3 結(jié)論

研究采用吸附樹脂分離純化原花青素，分別通過對HP20型大孔樹脂、AB-8型樹脂、D101型樹脂、Sepabeads SP700型大孔樹脂的純化過程進(jìn)行摸索，經(jīng)HPLC法分析，結(jié)果在相同質(zhì)量濃度的情況下，Sepabeads SP700型大孔樹脂純化的原花青素峰面積最大，因此Sepabeads SP700型吸附樹脂可以很好地富集原花青素。

黑豆為山西地產(chǎn)特色農(nóng)作物，在山西呂梁地區(qū)資源豐富，試驗(yàn)采用HPLC法測定山西產(chǎn)地黑豆皮中原花青素的含量，結(jié)果表明，該測定法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。近年來，黑豆皮藥食性的研究應(yīng)用越來越受到廣泛關(guān)注，其應(yīng)用潛力越來越大，試驗(yàn)為黑豆皮的原花青素品質(zhì)綜合評價及控制提供參考依據(jù)。黑豆皮中的不同官能團(tuán)的原花青素及其對抗氧化活性的影響，還有待于進(jìn)一步研究與開發(fā)。