不同炮制方法對菟絲子總黃酮和多糖含量及抗氧化能力的影響

燕宇真，王慧春，曾 陽

（青海師范大學生命科學學院，青海西寧 810099）

菟絲子（Semen cuscutae）為旋花科菟絲子屬菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）的種子。菟絲子被歷代醫(yī)家視為平補肝、腎、脾經(jīng)的要藥[1]，用于陽痿遺精、尿有余瀝、遺尿尿頻、腰膝酸軟、目昏耳鳴、腎虛胎漏、胎動不安、脾腎虛瀉和外治白癜風等病癥[2]。菟絲子的良好療效源自其含有的黃酮、多糖、生物堿、萜、甾體、揮發(fā)油和木質(zhì)素等化合物[3-7]。然而，《中華人民共和國藥典》 （本文簡稱《藥典》）僅對菟絲子的總灰分、酸不溶性灰分和金絲桃苷含量進行了描述。此外，在菟絲子的用藥歷史上存在鹽炙法、清炒法、粉碎法、酒炙法等多種炮制方法。但是，臨床用菟絲子的炮制方法大多為《藥典》規(guī)定的將菟絲子水洗曬干后使用的方法（本文簡稱“水洗曬干法”）。試驗綜合比較分析了雷公炮炙論中所記載的菟絲子炮制方法（簡稱“雷氏法”）、酒炙法、鹽炙法、粉碎水煮法、水煮吐絲法、清炒法和水洗曬干法等7種炮制處理的菟絲子分別在水和醇提取物中總黃酮和多糖含量及抗氧化能力，從而為科學加工和利用菟絲子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菟絲子，購于河北安國藥材市場。

試驗用FRAP，購于美國Sigma公司；乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BS200S型電子天平、QE-100g型高速中藥粉碎機、DZF-6030型真空干燥箱、KH5200B型超聲波清洗器、TGL-16型高速臺式冷凍離心機、UV-754型分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

將干凈干燥的菟絲子分為7組（每組300 g）。參照雷公炮制法和現(xiàn)代炮制工藝，設定了雷氏法、酒炙法、鹽炙法、粉碎水煮法、水煮吐絲法、清炒法和水洗曬干法等7種炮制方法。

（1） 雷氏法（LS）。參照雷敩等人[8]的方法：將100 g菟絲子用30 mL米醋浸泡72 h，瀝水，用微火煎至干后粉碎，烘干備用。

（2） 酒炙法（JZ）。參照張漢明[9]和李春雨等人[10]的方法，將100 g菟絲子用30 mL黃酒拌勻，濕潤24 h，再用流通蒸汽蒸1 h，取出趁熱搗成稠粥狀，做餅，切成小塊，烘干備用。

（3） 鹽炙法（YZ）。參照曾詮[11]和李春雨等人[12]的方法，將100 g菟絲子用30 mL鹽水（15∶1，V/W）拌勻，燜潤至鹽水盡，置鍋內(nèi)用文火炒至爆聲為度，放涼備用。

（4） 粉碎水煮法（FSSZ）。參照郭澄等人[13]的方法，將100 g菟絲子粉碎，加30 mL蒸餾水浸泡1 h，置鍋內(nèi)邊煮邊鏟，取出壓干成塊狀，烘干備用。

（5） 水煮吐絲法（SZTS）。參照郭澄等人[13]的方法，將100 g菟絲子加30 mL蒸餾水浸泡2 h，置鍋內(nèi)煮，邊煮邊鏟，至吐絲。稍冷取出壓平，做成塊狀，烘干備用。

（6） 清炒法（QC）。參照郭澄等人[13]的方法，將100 g菟絲子置鐵鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至微黃色，有爆裂聲，放涼備用。

（7） 水洗曬干法（SXSG）。 參照《藥典》[2]的方法將100 g菟絲子洗凈，曬干備用。

1.3.2 樣品提取

（1）水溶液超聲提取法。參照Samec D等人[14]的方法，取5 g菟絲子，加75 mL蒸餾水，于40℃下水浴超聲提取80 min，于轉速10 000 r/min下離心10 min，收集上清液備用。

（2） 醇溶液超聲提取法。參照伍曉春[15]的方法，取5 g菟絲子，加75 mL 15%乙醇，于40℃下水浴超聲提取80 min，于轉速10 000 r/min下離心10 min，收集上清液備用。

1.3.3 總黃酮和多糖含量及抗氧化能力測定

（1）總黃酮測定。參照伍曉春等人[15]的方法，精密移取5 mL提取液置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min，精密加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，精密加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，用1 cm比色皿于波長510 nm處測定吸光度，總黃酮濃度按照線性方程A=0.012 98C-0.011 94（R2=0.999 7） 計算。

（2） 多糖測定。參照Dubois M等人[16]的方法，精密移取5 mL提取液置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水補足至6 mL，搖勻，分別精密加入4%苯酚1 mL，混勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出放冷，于波長491 nm處測吸光度，多糖濃度按照線性方程A=0.049 7C+0.016 3（R2=0.999 7）計算。

（3） 抗氧化能力（FRAP） 測定。參照崔施展等人[17]的方法，取濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L FeSO4溶液300 μL，加入9 mL FRAP試劑，于37℃下水浴10 min，于波長593 nm處測定吸光度，以吸光度為X軸、FeSO4濃度為Y軸，擬合回歸方程。配制不同質(zhì)量濃度FeSO4提取物溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL，按照以上操作，測定樣品吸光度。樣品抗氧化活性以相同吸光度所需FeSO4表示。

1.3.4 統(tǒng)一粒度試驗

參照伍曉春[15]的方法，將菟絲子于80℃條件下干燥5 h，取出粉碎成細粉，過80目篩，備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 不同炮制方法對菟絲子總黃酮和多糖含量的影響

不同炮制方法制得菟絲子中總黃酮和多糖含量見表1。

由表1可知，相較于水洗曬干法制得的菟絲子，其余全部方法制得的菟絲子，總黃酮含量均有不同程度增加。水提物中，以雷氏法和粉碎水煮法炮制的菟絲子中總黃酮得率最高，二者含量分別為0.30%和0.23%，之后為酒灸法（0.17%） 和鹽灸法（0.15%），水煮吐絲法和清炒法制得的菟絲子總黃酮含量為0.13%，增長不明顯；在醇提物中，同樣以雷氏法和粉碎水煮法炮制的菟絲子中總黃酮得率最高，兩者含量為別為0.39%和0.36%。之后分別為酒灸法（0.22%）。鹽灸法、水煮吐絲法和清炒法制得的菟絲子中總黃酮含量相似，為0.18%左右。上述結果表明，雷氏法和粉碎水煮法能夠較其他炮制方法更好地促進菟絲子中黃酮類物質(zhì)的釋放。另外，醇提物中總黃酮含量明顯高于水提物，說明醇能夠更加高效提取菟絲子中黃酮類物質(zhì)，這是因為醇是更加高效的植物性小分子酚類物質(zhì)的提取劑[14]。

表1 不同炮制方法制得菟絲子中總黃酮和多糖含量/%

相較于水洗曬干法制得的菟絲子，只有部分其他方法制得的菟絲子多糖含量有不同程度增加。例如，采用粉碎水煮法、雷氏法和鹽灸法炮制得到的菟絲子中多糖含量增加明顯，分別達到了8.25%，6.24%和6.17%，之后為水煮吐絲法和清炒法；在醇提物中，粉碎水煮法和雷氏法制得的菟絲子中多糖含量增加明顯，分別達到了10.15%和4.90%，說明雷氏法和粉碎水煮法能夠較其他炮制方法更好地促進菟絲子中多糖物質(zhì)的釋放。結合對總黃酮含量的分析可以得出，雷氏法和粉碎水煮法能夠較好地促進菟絲子中功能物質(zhì)的釋放，建議在臨床使用中采用上述2種方法炮制菟絲子。造成這一現(xiàn)象的原因可能因為雷氏法、粉碎水煮法的炮制工藝中均含有粉碎工序，對菟絲子堅硬種皮進行了較徹底的粉碎處理，從而提高了其炮制品在水浸提時黃酮的溶出率，說明炮制效果好壞與種子的破碎程度有較大關系。同時也說明現(xiàn)行的藥典方法尚有不足之處，建議改進或增加新的炮制方法，并考慮作為藥典的方法。另外，其他方法制得的菟絲子，相較于水洗曬干法制得的菟絲子，多糖含量降低。例如，酒灸法制得的菟絲子水提物中多糖含量為2.58%；酒灸法、鹽灸法、水煮吐絲法和清炒法制得的菟絲子醇提物中多糖含量均低于水洗晾干法的3.85%。這說明醇提取多糖物質(zhì)效果沒有水好，這可能是因為多糖類物質(zhì)的分子量普遍大于黃酮類物質(zhì)。

2.2 不同炮制方法對菟絲子抗氧化能力的影響

不同炮制方法制得菟絲子的FRAP值見表2，不同炮制方法制得菟絲子的抗氧化能力、總黃酮和多糖含量的相關性見表3。

表2 不同炮制方法制得菟絲子的FRAP值 /mg·g-1

表3 不同炮制方法制得菟絲子的抗氧化能力、總黃酮和多糖含量的相關性

由表2可知，相較于水洗曬干法炮制的菟絲子，其他方法得到菟絲子的抗氧化能力均得到了提升，其中雷氏法、鹽灸法、破碎水煮法和清炒法對菟絲子的抗氧化能力提升效果較其他方法更加顯著。例如，雷氏法、鹽灸法和清炒法制得的菟絲子水提物的抗氧化力分別為8.66，8.08，8.32 mg/g；雷氏法、破碎水煮法和清炒法制得的菟絲子醇提物的抗氧化能力分別為13.14，12.10，10.30 mg/g。另外，醇提物的抗氧化能力總體高于水提物。造成這一結果的原因可能是，醇提物中總黃酮和多糖含量總體高于水提物。這也解釋了表1中，酒炙法制得的菟絲子總黃酮含量較生品均有增加，說明酒精能夠提高其所含成分的溶解度和可被吸收率。因此在日常應用中，菟絲子泡酒飲用有一定治療效果。

多酚和多糖是菟絲子活性能功能的主要貢獻物質(zhì)，黃酮參與了菟絲子的補腎、安胎、調(diào)節(jié)免疫力等作用；而多糖參與了菟絲子免疫作用[18]?？寡趸嵌喾雍投嗵俏镔|(zhì)實現(xiàn)功能活性的途徑之一。因此，對菟絲子水提物和醇提物抗氧化能力，總黃酮及多糖含量進行了相關性分析。由表3可知，無論是菟絲子的水提物還是醇提物，總黃酮和多糖含量均與其抗氧化能力呈正相關。結果表明，黃酮和多糖都對菟絲子的抗氧化能力起到正向促進作用。如表1和表2所示，菟絲子醇提物中含有更多的總黃酮和多糖，而具有更強的抗氧化能力。

2.3 粒度對菟絲子總黃酮和多糖含量及抗氧化能力的影響

出于尊重傳統(tǒng)炮制方法和實際用藥過程中的習慣，在進行上述各項試驗過程中，最大程度地保持了炮制完成后菟絲子的原貌，因此各種炮制品的粒度之間存在差異，這可能會對評價不同炮制方法對促進菟絲子活性物質(zhì)的釋放造成影響。因此，進一步將炮制后的菟絲子進行了統(tǒng)一粉碎，在統(tǒng)一粒度下來評價不同炮制方法對促進菟絲子活性物質(zhì)釋放的影響。另外，上述研究發(fā)現(xiàn)，醇在提取總黃酮物質(zhì)中具有良好效果，并且多糖提取的最大程度值是由醇提得到的，從而醇提物具有更強抗氧化能力。因此，采用醇作為提取劑來進一步評價不同炮制方法對促進菟絲子活性物質(zhì)釋放的影響。

統(tǒng)一粒徑菟絲子醇提物中總黃酮和多糖含量見表4。

表4 統(tǒng)一粒徑菟絲子醇提物中總黃酮和多糖含量

結合表1和表4可知，不同炮制方法之間的差異與統(tǒng)一粒徑之前相似，相比水洗曬干法制得的菟絲子，其他方法制得的菟絲子醇提物中總黃酮含量均增加，而除粉碎水煮法和清炒法制得的菟絲子多糖含量增加之外，其他方法制得菟絲子的多糖含量都不同程度地降低。但是無論是總黃酮還是多糖含量較統(tǒng)一粒徑之前整體增加。說明破碎程度越小，越容易促進菟絲子活性物質(zhì)的釋放。另外，結合表2和表4可知，不同方法炮制后的菟絲子，統(tǒng)一粒徑之后表現(xiàn)出來的抗氧化能力均有明顯提升。這可能與粒度減小促進了活性物質(zhì)的釋放有關。因此建議，臨床使用菟絲子應該再選取適當炮制方法之后對炮制品進行破碎處理降低粒度大小，以粉態(tài)物質(zhì)入藥，會促進活性物質(zhì)的釋放，從而增加其治療效果。

3 結論

對不同炮制方法制得的菟絲子的水提物和醇提物中的總黃酮和多糖含量及抗氧化能力進行了測試分析，結果表明，相較于水洗曬干法，其他方法炮制得到的菟絲子水提物中總黃酮和多糖含量均增加，從而具有更強抗氧化能力，說明現(xiàn)行《藥典》中規(guī)定的水洗曬干法需要進一步驗證。統(tǒng)一粒度試驗印證了破碎處理會促進菟絲子活性物質(zhì)的釋放，從而促進其抗氧化能力。雷氏法和破碎水煮法制得的菟絲子水提液和醇提液中總黃酮和多糖含量及抗氧化能力均有明顯增加，說明雷氏法和破碎水煮法會促進活性物質(zhì)的釋放并加強菟絲子功能活性，建議作為新方法用于菟絲子炮制。另外，試驗證明醇相較于水能夠更好地提取菟絲子活性物質(zhì)。因此，建議雷氏法、酒灸法和破碎水煮法連同破碎處理和醇提一起用于對菟絲子的入藥前處理。