基于“伴隨標(biāo)志物”在線控制技術(shù)的絞股藍(lán)總皂苷純化工藝及成分鑒定研究

范冬冬 匡艷輝　董利華　葉瀟　陳兩綿　張東　馬振山　王錦玉　朱晶晶　王智民　王德勤　李楚源

[摘要] 基于“伴隨標(biāo)志物”紫外在線檢測技術(shù)以絞股藍(lán)總皂苷（GPS）為目標(biāo)，優(yōu)化絞股藍(lán)中GPS的純化工藝，采用UPLCQTOFMS技術(shù)對GPS進(jìn)行定性?！鞍殡S標(biāo)志物”紫外在線檢測研究表明，上樣終點(diǎn)為流出液吸光度為原藥液的1/2時，洗脫終點(diǎn)為洗脫流出液吸光度基本穩(wěn)定。UPLCQTOFMS鑒定出GPS提取物中的16個皂苷，其中新皂苷3個。該研究優(yōu)選出的純化工藝簡單、檢測方便、易于在線測定、實(shí)時記錄，能較好的運(yùn)用到大生產(chǎn)或生產(chǎn)的自動化中。質(zhì)譜定性鑒定結(jié)果表明，基于“伴隨標(biāo)志物”紫外在線檢測技術(shù)能很好地保留藥材中的主要藥效成分，為過程控制和質(zhì)量溯源提供了分析工具。

[關(guān)鍵詞] 絞股藍(lán)總皂苷； 純化； 大孔吸附樹脂； 伴隨標(biāo)志物； 在線檢測； UPLCQTOFMS

Purifying process of gynostemma pentaphyllum saponins based on

"adjoint marker" online control technology and identification of

their compositions by UPLCQTOFMS

FAN Dongdong1，2， KUANG Yanhui3， DONG Lihua 2， YE Xiao 1，2， CHEN Liangmian2， ZHANG Dong 2，

MA Zhenshan2， WANG Jinyu2， ZHU Jingjing2*， WANG Zhimin2*， WANG Deqin3， LI Chuyuan3

（1. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China；

2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Institute of

Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China）

[Abstract] To optimize the purification process of gynostemma pentaphyllum saponins （GPS） based on "adjoint marker" online control technology with GPS as the testing index. UPLCQTOFMS technology was used for qualitative analysis. "Adjoint marker" online control results showed that the end point of load sample was that the UV absorbance of effluent liquid was equal to half of that of load sample solution， and the absorbance was basically stable when the end point was stable. In UPLCQTOFMS qualitative analysis， 16 saponins were identified from GPS， including 13 known gynostemma saponins and 3 new saponins. This optimized method was proved to be simple， scientific， reasonable， easy for online determination， realtime record， and can be better applied to the mass production and automation of production. The results of qualitative analysis indicated that the "adjoint marker" online control technology can well retain main efficacy components of medicinal materials， and provide analysis tools for the process control and quality traceability.

[Key words] gynostemma pentaphyllum saponins （GPS）； purification； macroporous absorptive resin； adjoint marker； online detecting； UPLCQTOFMS

絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum （Thumb.） Makino為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，有“南方人參”和“第二人參”的美譽(yù)，別名小苦藥、公羅鍋底、五葉藤、遍地生根，在日本民間稱“甘茶蔓”[12]。早在我國明代《救荒本草》中已有記載，絞股藍(lán)性寒味甘，具有清熱解毒、補(bǔ)氣生津、祛痰止咳、安神固精之功。絞股藍(lán)中主要活性成分為達(dá)瑪烷型皂苷類成分，且含量較高；它具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖、調(diào)血脂、保肝、抗氧化、抗?jié)円约翱顾ダ系榷喾N活性[3]。

絞股藍(lán)藥材品種來源較為混亂，不同產(chǎn)地同一品種、不同種植品種、不同藥用部位等，其皂苷含量及成分都存在很大差異，也許是迄今藥典尚未法定標(biāo)準(zhǔn)的難點(diǎn)所在。據(jù)悉絞股藍(lán)皂苷（GPS）提取物原料生產(chǎn)商使用的是根，而部頒標(biāo)準(zhǔn)WS3Z00693（Z）指定使用部位為全草；全草和根的成分存在很大差異，加上缺乏對照品，致使很多企業(yè)難以復(fù)制出其生產(chǎn)工藝。

純化皂苷的工業(yè)化常規(guī)手段是大孔吸附樹脂法，實(shí)際生產(chǎn)中往往主要依賴經(jīng)驗(yàn)的終點(diǎn)放行模式，或輔助旁線或離線手段（TLC法和分光光度法測定皂苷），加上對GPS的含量要求較高（要求“總皂苷≥80%”），實(shí)際生產(chǎn)中往往難以實(shí)現(xiàn)不間斷生產(chǎn)，甚至不得不反復(fù)純化，這樣又可能導(dǎo)致其次生皂苷成分的生成而致成分更復(fù)雜，生產(chǎn)的重復(fù)性和質(zhì)量的均一性很難保證，同時也難以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的自動化和連續(xù)化。為解決該問題，以洗脫液的旁線檢測（TLC檢測成分、UVVIS測定皂苷和含固量的測定）為指標(biāo)為指示，設(shè)計(jì)并建立洗脫液中“伴隨標(biāo)志物”（有UV吸收者）與皂苷（無UV吸收）間的關(guān)系，并以伴隨標(biāo)志物的吸光度作為快速判斷過程監(jiān)測和終點(diǎn)放行的指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對皂苷類成分在純化過程的“替代”在線控制和實(shí)時監(jiān)測。

本研究以絞股藍(lán)皂苷為對象，基于“伴隨標(biāo)志物”的紫外在線檢測，實(shí)現(xiàn)對無紫外吸收皂苷的過程控制，為工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)提供了一種簡單易行、準(zhǔn)確可靠的檢測技術(shù)；同時對純化得到的GPS進(jìn)行主成分定性分析，以保障原料與成品間質(zhì)量的可溯源性。

1 材料

梅特勒精密電子天平（XS105DU）；紫外可見分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)）；N1100型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海安亭科學(xué)儀器制造）；SB1100 EYELA水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHZD（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；TGL16G臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Xevo G2S QTOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；配有Lockspray 接口，電噴霧離子源（ESI），MassLynx4.1質(zhì)譜工作站；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱（Waters公司）。

絞股藍(lán)皂苷XLIX對照品（純度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇、乙醇、冰乙酸、高氯酸（分析純）、石油醚（分析純）、Fisher 乙腈、甲酸（質(zhì)譜純）、5%香草醛冰乙酸溶液；HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500，NKAⅡ大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩化工）；SP825L（北京綠百草）；絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)的干燥地上部分，實(shí)驗(yàn)用樣品為福建漳州絞股藍(lán)的葉子，品種鑒定經(jīng)葉華谷研究員鑒定為絞股藍(lán)G. pentaphyllum。

2 方法與結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)總皂苷的測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取絞股藍(lán)皂苷XLIX對照品10.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為2.00 g·L-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取絞股藍(lán)總皂苷10.00 mg，置2 mL離心管中，加石油醚2 mL，超聲處理10 min，6 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，殘?jiān)鼡]干，加甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取部分6 000 r·min-1離心10 min，得供試品。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取絞股藍(lán)皂苷XLIX對照品溶液（2.00 g·L-1）10，20，40，60，80，100 μL分別置15 mL具塞試管中，揮干，精密加入新配制的5%香草醛冰乙酸溶液與高氯酸（2∶8）的混合液2 mL，搖勻，密塞，置60 ℃水浴中加熱15 min，立即放入冷水中冷卻至室溫，分別精密加冰乙酸10 mL，搖勻，以試劑作空白，按照紫外可見分光光度法（《中國藥典》2010年版一部附錄VA）試驗(yàn)，在550 nm的波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=1.088 4X-0.003 3，r=0.999。結(jié)果表明，取樣量在0.01～0.20 mg 有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 絞股藍(lán)總皂苷含量測定方法

精密量取供試品200 μL置15 mL具塞試管中，揮干甲醇后按2.1.3項(xiàng)下操作，測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出絞股藍(lán)總皂苷的質(zhì)量。

2.2 大孔吸附樹脂型號篩選

2.2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)考察

2.2.1.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理 7種不同型號大孔吸附樹脂（HPD100HPD500，SP825L，NKAⅡ）分別用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用乙醇洗至溶液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時為止，最后用去離子水洗至無醇味，備用。

2.2.1.2 靜態(tài)吸附和解吸 30%乙醇回流提取2次，料液比為1∶8，每次提取1.5 h，合并提取液，減壓濃縮至生藥含量0.1 g·mL-1即為提取液。稱取各型號經(jīng)預(yù)處理的樹脂5 g（濕質(zhì)量）置于100 mL錐形瓶中，各加入絞股藍(lán)提取液50 mL，持續(xù)振搖30 min，靜置12 h后，抽濾，得吸附后的濾液。將吸附后的各型號樹脂濾出后分別另置100 mL錐形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，其余操作同上，得解吸后的濾液。精密量取吸附后的濾液100 μL、原料液30 μL和解吸后的濾液50 μL置15 mL具塞試管中，揮干后按2.1.3項(xiàng)下操作，測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得絞股藍(lán)總皂苷含量。單位樹脂飽和吸附量=（原料液總皂苷質(zhì)量-吸附后濾液總皂苷質(zhì)量）/濕樹脂的量；解吸率=解吸后的濾液總皂苷質(zhì)量/飽和吸附量×100%。根據(jù)以上公式計(jì)算每種樹脂對總皂苷的靜態(tài)飽和吸附量及解吸率（原料液總皂苷質(zhì)量為244.78 mg），結(jié)果見表1。

由表1可見，HPD系列樹脂的飽和吸附量及解吸率都優(yōu)于其他2種類型樹脂（SP825L，NKAⅡ），綜合吸附及解吸2方面因素考慮，可以認(rèn)為HPD系列樹脂對絞股藍(lán)總皂苷具有較好的吸附及解吸能力，因此選用HPD系列樹脂來進(jìn)行下一步考察。

2.2.2 HPD系列樹脂對絞股藍(lán)總皂苷的吸附

取絞股藍(lán)提取液6份，每份120 mL，1份蒸干得絞股藍(lán)提取物，稱重；另外5份分別通過預(yù)先處理好的HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500型大孔吸附樹脂柱，靜置過夜，再分別以2倍柱體積去離子水和3倍柱體積95%乙醇洗脫，95%乙醇洗脫液濃縮，干燥、收粉，得絞股藍(lán)總皂苷，稱重。同2.1.2的操作，在同一條件下測量吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得絞股藍(lán)總皂苷含量，見表2。

從表2可以看出，HPD系列大孔吸附樹脂對絞股藍(lán)提取液有很好的吸附和純化效果。綜合考慮幾種樹脂的吸附和解吸附能力，最終選用HPD500大孔吸附樹脂進(jìn)行絞股藍(lán)總皂苷的純化。

2.3 HPD500樹脂對總皂苷純化工藝的考察

2.3.1 “伴隨標(biāo)志物”紫外吸收與總皂苷的關(guān)系

取生藥量為 0.1 g·mL-1的提取液以3倍柱體積每小時的流速上樣，通過樹脂柱進(jìn)行吸附，吸附飽和后，靜置12 h，然后分別用10倍柱體積去離子水洗脫，再分別用10倍柱體積10%乙醇、7倍柱體積15%乙醇、8倍柱體積20%乙醇和10倍柱體積70%乙醇洗脫，每個柱體積為1個流分，收集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接進(jìn)行紫外檢測，然后計(jì)算每一個流分的總皂苷含量，建立每個流分的紫外吸收值與總皂苷含量之間的相關(guān)性，結(jié)果見圖1。

由上圖及數(shù)據(jù)可得，“伴隨標(biāo)志物”紫外吸收與總皂苷含量有正相關(guān)性，所以可以通過檢測“伴隨標(biāo)志物”的紫外吸收來監(jiān)測絞股藍(lán)總皂苷的含量變化。

2.3.2 上樣量的考察

2.3.2.1 最大吸收波長的確定 對濃縮處理好的原料液在600～800 nm波長下掃描。樣品在665 nm處有最大吸收，所以選擇檢測波長為665 nm。

2.3.2.2 上樣量在線檢測 常規(guī)方法通常采用每次測定流出液中皂苷含量來判斷泄露率，此操作繁瑣且出結(jié)果時間較長。因此考慮把泄露率與流出液的“絞股藍(lán)皂苷伴隨物”（簡稱伴隨物）紫外吸收關(guān)聯(lián)起來，從而通過測定出口洗脫液的“伴隨物”紫外吸收來判斷上樣終點(diǎn)，此方法簡單、方便、可行。

用處理好的HPD500樹脂裝柱，取生藥量為 0.1 g·mL-1的提取液測定樣品上樣液的紫外吸光度，以3倍柱體積每小時的流速不斷上樣，以1倍柱體積為1個流分，取其一半蒸干，計(jì)算各自的含固量及總皂苷含量，并計(jì)算泄露率，取另一半流分直接進(jìn)行紫外檢測，建立各流分的總皂苷泄露率與“伴隨物”紫外吸收間的相關(guān)性，確定最大上樣量，結(jié)果見圖2，實(shí)現(xiàn)通過紫外吸收值來判斷上樣終點(diǎn)的目的。

圖中連續(xù)考察了1～32倍柱體積的上樣量，分別統(tǒng)計(jì)了各流分中絞股藍(lán)總苷泄露率和相應(yīng)的紫外吸光度。當(dāng)上樣量為21倍柱體積時，流出液中絞股藍(lán)皂苷泄露率92.90%；流出液的吸光度0.172，原料液吸光度0.328；當(dāng)上樣量為22倍柱體積時，洗脫液的絞股藍(lán)皂苷泄露率為102.34%，對應(yīng)的吸光度為0.178，因此當(dāng)絞股藍(lán)皂苷達(dá)100%泄露時，洗脫液的“伴隨物”紫外吸光度接近于原料液紫外吸光度的1/2。由此建議，當(dāng)出口洗脫液與上樣原料液紫外吸光度比值為1∶2時，即確定為上樣終點(diǎn)。

2.3.3 洗脫梯度考察

2.3.3.1 梯度洗脫 提取液以3倍柱體積每小時的流速上樣，通過樹脂柱進(jìn)行吸附，吸附飽和后，靜置12 h，然后分別用8倍柱體積去離子水洗脫，再分別用8倍柱體積15%乙醇和8倍柱體積70%乙醇洗脫，每個柱體積為1個流分，收集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接進(jìn)行紫外檢測，然后計(jì)算每個流分的含固量及總皂苷含量，建立每個流分的紫外吸收值與含固量及總皂苷含量之間的相關(guān)性，通過紫外吸收度來判斷每個梯度洗脫終點(diǎn)。

2.3.3.2 最大吸收波長的確定 分別選取各梯度洗脫液1份在500～800 nm波長下掃描。本著吸光度小于1，且各梯度均有良好的吸收，故選擇在555 nm作為檢測波長。

2.3.3.3 洗脫梯度在線檢測 建立每個流分的“伴隨物”紫外吸收、含固量及總皂苷含量關(guān)系圖，結(jié)果見圖3。

由圖可得，當(dāng)洗脫流出液吸光度基本穩(wěn)定時可換下一個梯度進(jìn)行洗脫，用70%乙醇洗脫時，吸光度基本穩(wěn)定時就是洗脫終點(diǎn)。

2.4 純化工藝驗(yàn)證

用處理好的HPD500樹脂20 mL裝柱，取生藥含量為0.1 g·mL-1的提取液上樣，通過紫外檢測下口流出液紫外吸收為上樣液的1/2時即為上樣飽和，靜態(tài)吸附12 h后進(jìn)行洗脫，樹脂柱先分別用去離子水和15%乙醇洗脫除雜，除雜終點(diǎn)為下口流出液吸光度基本穩(wěn)定，然后用70%乙醇洗脫，洗脫終點(diǎn)同樣是流出液吸光度基本穩(wěn)定且吸光度很小，收集70%乙醇洗脫餾分減壓濃縮，濃縮液減壓蒸干，得絞股藍(lán)總皂苷。同2.1.2的操作，在同一條件下測量吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得總皂苷的純度為84.24%，皂苷轉(zhuǎn)移率65.50%，可見經(jīng)優(yōu)選的工藝是可行的。

2.5 總皂苷UPLCQTOFMS定性分析

2.5.1 供試液的制備

稱取絞股藍(lán)總皂苷3.73 mg，2 mL甲醇溶解，離心（12 000 r·min-1，10min），取上清液，即得。

2.5.2 UPLCMS條件

2.5.2.1 UPLC條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A） 0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～3 min，30%～35%A；3～8 min，35%～45%A；8～12 min，45%～60%A；12～15 min，60%～80%A）；流速0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積1 μL；柱溫35 ℃；自動進(jìn)樣器溫度20 ℃；PDA檢測器掃描范圍200～400 nm。

2.5.2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，正負(fù)離子模式掃描，毛細(xì)管電壓為2 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣體流量600 L·h-1，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣體流量50 L·h-1，母離子碰撞能量6 eV，碎片離子碰撞能量20～50 eV，掃描范圍m/z 100～2 000，掃描時間0.2 s。

2.5.3 絞股藍(lán)總皂苷UPLCQTOFMS定性分析

通過對照品比對、UPLCMS碎片信息以及結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，從絞股藍(lán)總皂苷中共指認(rèn)16個化合物，其中包括13個已知和3個新皂苷，結(jié)果見表3。其總離子流圖見圖4。

指認(rèn)的16個化合物中，其中化合物3即Gyp ⅩLⅥ是通過對照品比對得出，其余都是結(jié)合碎片信息及查閱相關(guān)文獻(xiàn)得出。已知的13個皂苷中，其母核結(jié)構(gòu)見圖5，其中主要是類型I的化合物。絞股藍(lán)皂苷不僅有不同的母核結(jié)構(gòu)，而且還連有不同的糖鏈，所以絞股藍(lán)皂苷中存在著大量的同分異構(gòu)體。通過UPLCQTOFMS定性分析時，同一個分子離子峰會對應(yīng)著不同的化合物。根據(jù)裂分規(guī)律及碎片離子信息，推測化合物6中含有3個葡萄糖、1個五碳糖和1個乙酰基，化合物10中含有3個葡萄糖和1個乙?；?，化合物14中含有2個葡萄糖和1個乙?；?，這3種化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道，是3個新的絞股藍(lán)皂苷。

3 討論

大孔樹脂吸附分離純化中藥是一個比較復(fù)雜的過程，對成分有吸附和分子篩等不同機(jī)制。對于純化特定類別的成分達(dá)到“盡可能少地?fù)p失擬要成分，盡可能多地去除雜質(zhì)”才是最理想的狀態(tài)，要實(shí)現(xiàn)該目的，對生產(chǎn)過程的實(shí)時在線監(jiān)測就顯得尤為重要。對于黃酮類成分，由于其自身有紫外吸收，在純化總黃酮的過程中可以較容易利用紫外檢測器實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)品生產(chǎn)全過程進(jìn)行在線檢測和過程控制，特別是終點(diǎn)放行及其標(biāo)準(zhǔn)的制定；而該方法顯然不適用于皂苷類成分（無紫外吸收），無法直接進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和在線控制；要實(shí)現(xiàn)對皂苷的過程控制，一般都是要對洗脫液進(jìn)行取樣、濃縮、化學(xué)反應(yīng)、可見光檢測等，才能了解洗脫液的皂苷含量情況，進(jìn)而判定終點(diǎn)，這樣顯然時間長、操作繁瑣、準(zhǔn)確度差，無法滿足產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需求。因此，開發(fā)適于無紫外吸收的皂苷類物質(zhì)的在線快速檢測方法和技術(shù)對產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)對“伴隨標(biāo)志物”的紫外吸收與皂苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，通過檢測洗脫液的紫外吸收來判定上樣終點(diǎn)以及洗脫過程起點(diǎn)與終點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測和在線控制，該技術(shù)可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)前景。

絞股藍(lán)品種繁多，不同產(chǎn)地絞股藍(lán)皂苷主成分差異很大，共有成分稀少甚至沒有，這對絞股藍(lán)藥材及提取物的質(zhì)量控制是一個挑戰(zhàn)?，F(xiàn)采用UPLCQTOFMS技術(shù)可以快速、明確的指認(rèn)出絞股藍(lán)總皂苷提取物中主要的絞股藍(lán)皂苷，這可為絞股藍(lán)提取物質(zhì)量控制提供一種技術(shù)手段，同時還為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]