外泌體在腫瘤中的作用及前景*

王萌萌 綜述，孔凡虹，宗曾艷，熊 丹,張秀明△ 審校

(1.深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232000)

外泌體最初發(fā)現(xiàn)于網(wǎng)織紅細(xì)胞分化過(guò)程中，是胞漿內(nèi)的多囊泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到胞外基質(zhì)的直徑40～100 nm 的膜性囊泡。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)幾乎所有細(xì)胞都可分泌外泌體，且在唾液、尿液、血液、精液、羊膜液、腹水、肺泡灌洗液、乳汁、關(guān)節(jié)滑液及腦脊液等多種體液中均有分布[1]。而在所有類(lèi)型的細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體尤為旺盛。外泌體中含有多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等，外泌體可介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)和信息傳遞，參與抗原提呈、免疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)和RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)等生理和病理過(guò)程。惡性腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體，可攜帶多種腫瘤細(xì)胞特征性DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)及各種蛋白等，進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間傳遞，刺激腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。此外，由于外泌體中含豐富的母體信息且廣泛分布于各種體液，便于獲取的特點(diǎn)，對(duì)腫瘤的早期篩查、診斷及預(yù)后評(píng)估也具有重要意義。

1 外泌體、微泡及其他胞外囊泡的產(chǎn)生過(guò)程及機(jī)制

細(xì)胞分泌的胞外囊泡大致包括外泌體、微泡、凋亡小體，主要是按照形成方式的不同來(lái)劃分[3]。外泌體產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)體系統(tǒng)，隨后早期內(nèi)體發(fā)育為晚期內(nèi)體，晚期內(nèi)體膜內(nèi)陷形成多泡小體(MVEs)，最后多泡小體與細(xì)胞膜融合，其內(nèi)大小形態(tài)均一的內(nèi)腔囊泡(ILVs)被釋放到細(xì)胞外，即為外泌體[4]。在此過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸可被分選進(jìn)入ILVs中。同時(shí)，晚期內(nèi)體還可與溶酶體結(jié)合對(duì)內(nèi)容物進(jìn)行降解，或與再循環(huán)內(nèi)體結(jié)合參與內(nèi)容物的回收利用。微泡是由胞漿膜直接向胞外“出芽”產(chǎn)生，直徑為50～1 000 nm，沒(méi)有明確的分子標(biāo)志，膜成分與原始胞漿膜類(lèi)似。凋亡小體產(chǎn)生于細(xì)胞凋亡過(guò)程中，直徑為500～2 000 nm，其內(nèi)含有胞質(zhì)及細(xì)胞器[5]。

眾多研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT)參與了ILVs和MVEs的合成[6]。ESCRT系統(tǒng)包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、SCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ 4種蛋白復(fù)合物。ESCRT-0能夠識(shí)別并隔離內(nèi)體膜上的泛素化蛋白質(zhì)，接著在ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ的共同作用下，質(zhì)膜變形并向內(nèi)凹陷形成小泡，最后在ESCRT-Ⅲ的剪切作用下與內(nèi)體質(zhì)膜分離。ESCRT-Ⅲ最終被ATP酶降解失去活性[7]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)外泌體生物合成過(guò)程并非完全依賴(lài)于ESCRT機(jī)制，有研究者發(fā)現(xiàn)在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系分泌的外泌體中，PLP的分選不依賴(lài)于ESCRT系統(tǒng)參與，而與神經(jīng)酰胺有關(guān)[8]。外泌體釋放到細(xì)胞外后，可通過(guò)胞膜融合、內(nèi)吞及與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合3種方式進(jìn)入靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間的信息傳遞。

2 外泌體的內(nèi)容物

外泌體為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性分子[9]。外泌體內(nèi)容物蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等組成隨細(xì)胞類(lèi)型不同而有所差異，同一類(lèi)型細(xì)胞在不同的外界刺激下如低氧、高糖、炎性反應(yīng)等，其外泌體的蛋白質(zhì)和核酸成分也有所改變[10]。

近幾年來(lái)，通過(guò)對(duì)外泌體蛋白組學(xué)分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)4 000種蛋白質(zhì)可在外泌體中分離，這些蛋白質(zhì)一部分在進(jìn)化上保守，與來(lái)源細(xì)胞無(wú)關(guān)，另一部分隨來(lái)源細(xì)胞不同而存在差異，具有細(xì)胞來(lái)源特異性。外泌體中含有的蛋白質(zhì)包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白如GTP酶、annexins、Rab、flotillins，參與MVEs合成的蛋白如Tsg101、Alix，四次跨膜蛋白(如CD9、CD81、CD82、CD83、CD63，熱休克蛋白如Hsc60、Hsp90[11]。此外，細(xì)胞骨架蛋白、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、抗原呈遞相關(guān)蛋白(MHCⅠ、Ⅱ等)、細(xì)胞信號(hào)通路蛋白也在外泌體中廣泛存在。四次跨膜蛋白、Alix、flotillin、Tsg101、Rab56被作為外泌體特異性的分子標(biāo)志[12]。

除了蛋白質(zhì)，外泌體也富含豐富的鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神經(jīng)酰胺等成分，主要是細(xì)胞質(zhì)膜類(lèi)似成分及隨來(lái)源細(xì)胞不同而變化的特殊脂類(lèi)[13]。其中，骨形成蛋白、膽固醇、氧甾酮、神經(jīng)酰胺、磷脂酸、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等參與了外泌體的合成過(guò)程，外泌體被靶細(xì)胞識(shí)別與脂質(zhì)受體的參與有關(guān)。此外，外泌體攜帶具有生物活性的脂質(zhì)分子在細(xì)胞之間傳遞，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝具有一定的作用[13]。

外泌體內(nèi)含有豐富的核酸，包括基因組DNA、大量的mRNA、miRNA、LncRNA等。惡性乳腺癌細(xì)胞的外泌體中還含有mtDNA[14]。外泌體中的mRNA可被靶細(xì)胞攝取并在靶細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)，揭示了通過(guò)外泌體介導(dǎo)細(xì)胞之間基因傳遞的方式。

3 外泌體參與腫瘤多種生理病理過(guò)程

越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之間的信息傳遞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃逸等發(fā)揮重要作用。

3.1外泌體與腫瘤生長(zhǎng)、增殖 腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能夠影響非腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤微環(huán)境從而更利于腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。已有多種體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：加入腫瘤外泌體的實(shí)驗(yàn)組同等條件下細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)更多[15]。如腫瘤外泌體所含的生物活性成分隨外泌體進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，被包括內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在內(nèi)的正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞自身攝取，導(dǎo)致下游信號(hào)通路的改變，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲等產(chǎn)生影響，使其更有利于腫瘤的發(fā)展。腫瘤細(xì)胞外泌體中富含多種致癌性miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221、miR-451等，外泌體就攜帶致癌性miRNA在惡性腫瘤細(xì)胞之間傳遞，可能是調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、侵襲的機(jī)制[16]。腫瘤細(xì)胞外泌體中含有的生存素和熱激蛋白等能夠抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤的增殖。如YANG等[17]證明膀胱癌細(xì)胞外泌體能誘導(dǎo)三級(jí)膀胱癌細(xì)胞系(T24)的抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平上升和凋亡基因表達(dá)水平下調(diào)從而促進(jìn)T24增殖。DONG等[16]最近的一項(xiàng)研究證明人類(lèi)臍帶間質(zhì)充干細(xì)胞分泌的外泌體miR-410能促進(jìn)肺腺癌的生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，外泌體在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中扮演著重要角色。綜上所述，腫瘤外泌體所含的蛋白及RNA在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中有重要作用。

3.2外泌體誘導(dǎo)腫瘤血管生成 腫瘤外泌體中含有豐富的血管生成因子能夠誘導(dǎo)腫瘤血管生成。研究表明腫瘤細(xì)胞外泌體中存在的多種信號(hào)分子，如c-Src、IGF-IR、GRK5和GRK6，以及c-Src具有促進(jìn)腫瘤血管生成的潛能[18]。MROWCZYNSKI等[19]的實(shí)驗(yàn)證明攜帶H63D HFE基因變體的神經(jīng)母細(xì)胞瘤外泌體也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和WT HFE細(xì)胞的血管生成。人腦內(nèi)皮細(xì)胞能通過(guò)攝取外泌體分泌的VEGF-A提高血管生成的潛能。腫瘤細(xì)胞缺氧時(shí)，能促進(jìn)肺癌細(xì)胞分泌富含miR-23a的外泌體，miR-23a能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的EGLN2 和 EGLN1導(dǎo)致HIF1α累積從而促進(jìn)血管生成[20]。由此，可以推斷外泌體可通過(guò)血管生成蛋白和外泌體miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)促進(jìn)血管生成。

3.3外泌體與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移 向遠(yuǎn)處侵襲及轉(zhuǎn)移是腫瘤的重要特征之一。研究表明，腫瘤產(chǎn)生的外泌體能夠通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。加上外泌體可攜帶功能性蛋白質(zhì)及核酸分子向血清、尿液、腦脊液、唾液等多種體液釋放，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)外泌體可透過(guò)血腦屏障向血液循環(huán)釋放，有理由推測(cè)，外泌體在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。許多研究通過(guò)對(duì)腫瘤外泌體miRNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種miRNA表達(dá)上調(diào)。如早期乳腺癌進(jìn)行淋巴道轉(zhuǎn)移時(shí)，外泌體miR-222表達(dá)上調(diào)。而miR-222通過(guò)直接靶向作用于腫瘤抑制因子PDLIM2，激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)早期乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。ZHANG等[22]研究證明胃癌細(xì)胞釋放的外泌體可攜帶EGFR進(jìn)入肝臟。隨后EGFR與肝基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，通過(guò)抑制miR-26a/b有效激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。HGF為轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞提供“沃土”，促進(jìn)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞在肝臟的增殖[22]。故外泌體介導(dǎo)的胞間交流在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。

3.4腫瘤免疫逃逸 腫瘤外泌體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制功能，通過(guò)免疫細(xì)胞傳遞基因組DNA、mRNA和miRNA，從而使應(yīng)答細(xì)胞具有重編程功能，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。外泌體可通過(guò)向免疫細(xì)胞傳遞抑制蛋白影響免疫細(xì)胞的發(fā)育、成熟和抗腫瘤活性。HSU等[23]表明，缺氧可以加速肺癌細(xì)胞的外泌體分泌，從而使外泌體攜帶的miR-103從缺氧的癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞，通過(guò)下調(diào)PTEN 增強(qiáng)M2的極化。從而使肺癌細(xì)胞通過(guò)外泌體抑制腫瘤巨噬細(xì)胞功能。此外腫瘤外泌體或可通過(guò)抑制免疫細(xì)胞功能以逃避腫瘤的免疫檢測(cè)。有研究將shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞中敲除Rab27a(DU145KD)基因抑制其外泌體分泌，發(fā)現(xiàn)當(dāng)負(fù)載到樹(shù)突狀細(xì)胞時(shí)，DU145KD比對(duì)照組DU145細(xì)胞引發(fā)更強(qiáng)的抗腫瘤特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答[24]。且外泌體可在免疫細(xì)胞向促腫瘤發(fā)生和促轉(zhuǎn)移表型修飾中發(fā)揮作用。VAN DER VOS等[25]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體可通過(guò)將miR21和miR451的傳遞將小神經(jīng)膠質(zhì)或巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)為免疫抑制表型。隨后證明了這種miRNA的轉(zhuǎn)移降低了受體小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的c-Myc mRNA，這可能是免疫抑制表型的致病因素。

4 外泌體在分子標(biāo)志物方面的研究進(jìn)展

外泌體參與腫瘤多種生理活動(dòng)，且與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞可釋放更多數(shù)量的外泌體，預(yù)示著其可能作為一種潛在的生物標(biāo)記物用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后、放化療敏感性評(píng)估，以及治療研究。腫瘤細(xì)胞可釋放外泌體進(jìn)入腫瘤微環(huán)境、血清、尿液、腦脊液及患者血液循環(huán)中。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清外泌體的某些特定RNA和蛋白質(zhì)與健康者相比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如研究證明通過(guò)循環(huán)外泌體GPC1水平測(cè)定，能從健康人樣本中準(zhǔn)確區(qū)分PDAC患者樣本[26]。說(shuō)明外泌體可作為一種新的生物標(biāo)志物，為方便取材的血清或尿液基因診斷取代創(chuàng)傷大的組織活檢開(kāi)拓了新的思路。液體活檢的最大優(yōu)勢(shì)是能夠在監(jiān)測(cè)和規(guī)劃治療前后提供臨床信息。研究證明循環(huán)外泌體是腫瘤相關(guān)分子(尤其是miRNA)的可靠來(lái)源，外泌體中特異性蛋白質(zhì)和miRNA的表達(dá)反映了它們的供體細(xì)胞的生理特性[27]。所有的腫瘤都分泌外泌體且與正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體含量更多[28]。且隨著腫瘤的發(fā)展，外泌體內(nèi)容物的含量和質(zhì)量都會(huì)有所改變，可以借此很好地判斷腫瘤所在的階段。另外，由于脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的保護(hù)，外泌體能在長(zhǎng)期極低的溫度下維持穩(wěn)定狀態(tài)保護(hù)生物學(xué)特性，具有易于長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存的特征[29]。當(dāng)前，已有公司(Exosome Diagnostics)推出全球首個(gè)基于外泌體RNA的液體活檢產(chǎn)品，這是一種基于血漿外泌體的診斷，可靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的EML4-ALK突變。說(shuō)明外泌體液體活檢技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷是必然趨勢(shì)[30]。KAHLERT等[31]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清外泌體KRAS 和 TP53基因突變，另外一項(xiàng)研究證明外泌體KRAS突變比CA19-9的水平測(cè)量更有利于胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后分層分析[32]。由此可見(jiàn)，外泌體DNA也可為生物標(biāo)志物來(lái)源。

5 外泌體在腫瘤治療中的應(yīng)用

外泌體作為一類(lèi)細(xì)胞來(lái)源的天然膜結(jié)構(gòu)，是機(jī)體內(nèi)存在的一種天然的細(xì)胞之間的交流媒介，能夠傳遞功能性的生物分子到靶細(xì)胞。此外由于脂質(zhì)雙分子層的保護(hù)，使其內(nèi)容物不在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中降解。因此，在藥物遞送方面的應(yīng)用研究愈發(fā)受到重視，同時(shí)，利用外泌體增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)抗腫瘤的能力對(duì)腫瘤進(jìn)行治療也得到了更多的研究。目前，外泌體在腫瘤治療方面的應(yīng)用主要集中在以下方面：用于免疫調(diào)節(jié)治療，作為傳輸化學(xué)治療藥物的載體或治療靶標(biāo)[33]。外泌體作為藥物傳輸載體具有其天然優(yōu)勢(shì)：分子量小，固有的細(xì)胞靶向性，循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，能自由通過(guò)血腦屏障，同時(shí)，由于外泌體來(lái)源于人體，所以能成功規(guī)避免疫排斥反應(yīng)[34]。SEO 等[35]研究顯示，健康小鼠CD8+T細(xì)胞活化后，細(xì)胞毒外泌體瞬間釋放，新生小鼠細(xì)胞毒外泌體浸潤(rùn)間葉細(xì)胞密度高的血管區(qū)域。MSC的消耗與CD8+T細(xì)胞外泌體的優(yōu)先吞噬有關(guān)。說(shuō)明CD8+T細(xì)胞除了對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒性外，還能釋放外泌體，殺傷間充質(zhì)干細(xì)胞，抑制腫瘤進(jìn)展。LI等[36]通過(guò)小鼠模型發(fā)現(xiàn)結(jié)合A33抗體氧化鐵納米顆粒(A33Ab-US)的A33陽(yáng)性外泌體具有良好的大腸癌靶向性，能夠靶向遞送阿霉素從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低心臟毒性延長(zhǎng)小鼠的生存期。這項(xiàng)研究表明外泌體能與目標(biāo)配體結(jié)合靶向傳遞抗腫瘤藥物，從而達(dá)到腫瘤治療的目的。ZHANG等[37]利用細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)模型證明外泌體通過(guò)在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)siRNA能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，表明外泌體外泌體可以作為siRNA的載體用于靶向癌癥治療。目前由于外泌體的標(biāo)準(zhǔn)分離方法的缺乏，以及過(guò)低的藥物裝載效率，ZHANG等[38]已根據(jù)外泌體的免疫治療作用制造出仿生人工嵌合外泌體(ACEs)有望代替天然外泌體用于臨床腫瘤靶向治療。

6 小 結(jié)

綜上所述，外泌體是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，攜帶具有功能性的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)分子，參與惡性腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間的信息傳遞，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管新生及免疫逃逸等過(guò)程有重要的意義。此外，人體體液中來(lái)源的外泌體，包含了多種不同細(xì)胞來(lái)源成分，尋找針對(duì)不同細(xì)胞來(lái)源的特異性分子標(biāo)志物，對(duì)體液中外泌體的研究及未來(lái)“液體活檢”的發(fā)展也有重要意義，如用于腫瘤診斷及預(yù)后復(fù)發(fā)的指標(biāo)。此外通過(guò)對(duì)外泌體內(nèi)容物的分析也可以判斷腫瘤的分期，分級(jí)和進(jìn)展及腫瘤表型的分類(lèi)和預(yù)后。將外泌體運(yùn)用到精準(zhǔn)醫(yī)療中，可以檢測(cè)那些無(wú)法通過(guò)組織活檢鑒定的腫瘤突變，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，提高癌癥患者生存率。在治療方面，將其作為治療藥物傳輸?shù)妮d體用于腫瘤治療也得到了相關(guān)的研究，相信隨著對(duì)外泌體認(rèn)識(shí)的加深，以及越來(lái)越先進(jìn)的外泌體分離、及藥物裝載方法的出現(xiàn)，其臨床應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣闊，針對(duì)外泌體的腫瘤靶向治療方法也會(huì)為患者帶來(lái)新的治療希望。