隱球菌感染診斷的研究進(jìn)展*

賴 銳，邱玉芳，劉惟優(yōu)

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2016級(jí)碩士研究生;2.第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西 贛州 341000)

隱球菌是一種無(wú)菌絲的單細(xì)胞芽生的酵母型真菌，廣泛存在于空氣、土壤、樹木和鴿糞中[1-2]。致病菌主要包括新型隱球菌和格特隱球菌，其分子分型目前主要分5型：血清型A、D、 AD、B和血清型C，前三型多見(jiàn)于新型隱球菌，后兩型多見(jiàn)于格特隱球菌[3]。全球每年約有100萬(wàn)人感染隱球菌，并且造成約63萬(wàn)人死亡[4-7]。新型隱球菌多見(jiàn)于撒哈拉以南非洲，主要感染免疫功能低下，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和器官移植者[8]，而格特隱球菌多見(jiàn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，但曾在溫哥華島爆發(fā)流行，常感染免疫功能正常的宿主[8]。有研究報(bào)道：在中國(guó)，最常見(jiàn)的真菌病原體是假絲酵母屬，其次是隱球菌屬(7.7%)。近年以來(lái)，我國(guó)隱球菌屬的感染逐漸增加，無(wú)論是大陸還是臺(tái)灣都以新生隱球菌菌株的血清型A、基因型VNI和交配型α占主導(dǎo)地位，且多見(jiàn)于免疫功能正常者，但HIV感染仍然是我國(guó)隱球菌病最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素[2,9]。

近年來(lái)，廣譜抗生素、HIV感染、腫瘤放療和化療、器官移植、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等的增加也使隱球菌感染的發(fā)病率增加[10-11]，且患病率和致死率也在全球范圍內(nèi)升高，有研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)高危因素的隱球菌病比存在高危因素的隱球菌病的診斷需多2倍時(shí)間，導(dǎo)致死亡率升高究其原因是對(duì)隱球菌感染的的認(rèn)識(shí)不夠，未能早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療[12-13]。本文主要根據(jù)近幾年隱球菌感染的診斷方法從血液學(xué)、病原學(xué)、影像學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)以及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行闡述。

1 血液學(xué)檢查

一般血液學(xué)檢測(cè)無(wú)特異性，很難與病毒、細(xì)菌感染鑒別。血白細(xì)胞計(jì)數(shù)可正?；蜉p中度升高，多數(shù)在10 ×109·L-1～ 20×109·L-1之間, 中性粒細(xì)胞可輕度升高，病情進(jìn)展中后期可出現(xiàn)血紅蛋白及紅細(xì)胞數(shù)減少。感染指標(biāo)：C反應(yīng)蛋白(CPR)或降鈣素原(PCT)都可輕度升高，也可出現(xiàn)血沉加快。隱球菌患者血清1，3-β-D葡聚糖(G試驗(yàn))常為陰性，這是由于隱球菌細(xì)胞壁中1，3-β-D葡聚糖含量少且外層包裹很厚的莢膜多糖所導(dǎo)致的。而血半乳糖甘露聚糖試驗(yàn)(GM試驗(yàn))陽(yáng)性率也很低，只有在隱球菌抗原滴度很高時(shí)，才易檢出[14]。

2 病原學(xué)涂片和培養(yǎng)

檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，常用于疾病篩查，標(biāo)本相對(duì)容易收集。標(biāo)本主要包括痰、肺泡灌洗液、胸水、血液、腦脊液和尿液等。

2.1痰涂片和培養(yǎng)可見(jiàn)真菌孢子或隱球菌孢子包囊提示陽(yáng)性，該檢查法標(biāo)本易收集，費(fèi)用便宜，有助于篩查，但兩者陽(yáng)性率都較低，分別為25%和55%～80%，且缺乏特異性[15-16]。由于兩者的陽(yáng)性率與收集標(biāo)本途徑密切相關(guān)，所以條件允許下，可進(jìn)行有創(chuàng)檢查(如經(jīng)纖維支氣管鏡保護(hù)性毛刷、肺泡灌洗或經(jīng)支氣管壁透壁肺活檢、彩超引導(dǎo)下胸腔穿刺采取胸腔積液等)。若培養(yǎng)和(或)鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可確診，但單次培養(yǎng)陽(yáng)性并不能區(qū)分污染、定植和感染，所以對(duì)懷疑隱球菌肺感染者，應(yīng)反復(fù)多次多途徑培養(yǎng)，只有多次培養(yǎng)陽(yáng)性才有參考價(jià)值。此外，若AIDS患者痰培養(yǎng)新生隱球菌陽(yáng)性，應(yīng)提高警惕，其可能存在播散性感染。

2.2腦脊液(CSF) 墨汁染色涂片是診斷隱球菌性腦膜炎最簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法，其靈敏度與是否感染HIV也密切相關(guān)，未感染和感染HIV的隱球菌腦膜炎靈敏度分別為30%～50%和80%[17]，對(duì)腦脊液進(jìn)行離心后鏡檢可以增加靈敏度，但淋巴細(xì)胞、髓小球、脂肪小滴、組織細(xì)胞以及其他酵母形式易導(dǎo)致假陽(yáng)性，且該檢測(cè)方法不能判斷臨床治療療效。有人提出，吖啶橙染色靈敏度為96%，可以替代墨汁染色[18]。樊新紅等研究顯示[19]，腦脊液阿立新蘭染色對(duì)隱球菌的檢出率可達(dá)95.8%，其可以使隱球菌莢膜內(nèi)的酸性黏多糖著色，而對(duì)其他炎癥細(xì)胞不著色，且其檢測(cè)方法也簡(jiǎn)便。CSF培養(yǎng)陽(yáng)性可見(jiàn)乳白色奶油菌落生長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間孵育后可能變成橙黃色或棕色菌落，這可確診中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染。HIV感染者培養(yǎng)陽(yáng)性率高于非感染者，可達(dá)90%，而隱球菌腦炎或腦膜炎患者的血培養(yǎng)陽(yáng)性率僅70%[20]。

3 影像學(xué)

為隱球菌感染的輔助診斷方法，影像表現(xiàn)變化多樣，且缺乏特異性，但其可作為篩查手段，也可作為病情轉(zhuǎn)歸的評(píng)估方法。此外，MRI可辨別隱球菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可與腫瘤相鑒別。

3.1肺隱球菌病的肺部CT 表現(xiàn)可分為以下三種類型[21-23]：①結(jié)節(jié)或腫塊型：以單發(fā)或多發(fā)結(jié)節(jié)型多見(jiàn)，約占 40%～60%，常見(jiàn)于單側(cè)下肺外帶靠近胸膜處，呈寬基底，結(jié)節(jié)大小不一，邊緣可有分葉、毛刺、胸膜牽拉征，約40%結(jié)節(jié)周邊可伴有暈征，是肺隱球菌病相對(duì)特異性的影像學(xué)表現(xiàn)，但仍需與轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性肺癌相鑒別。②浸潤(rùn)實(shí)變型：多見(jiàn)于免疫功能低下者，表現(xiàn)為大片或斑片狀影，呈大葉性或節(jié)段性分布，少數(shù)患者可見(jiàn)支氣管充氣征，而聚集型分布、支氣管充氣征(多見(jiàn)于免疫功能正常者)是其相對(duì)特異性的CT影像可以與其他侵襲性真菌病鑒別。③混合型：常表現(xiàn)為多種形態(tài)和密度混合存在，多見(jiàn)于晚期播散性患者，易與肺結(jié)核相混淆。此外，約20%的患者伴有空洞性病變，多見(jiàn)于伴有HIV感染者，常呈局灶性、厚壁、偏心，內(nèi)壁光滑的空洞，也可見(jiàn)薄壁和(或)中心空洞[24]；有少數(shù)患者，可見(jiàn)腫大的肺門淋巴結(jié)，未見(jiàn)鈣化灶，肺間質(zhì)磨玻璃影和肺野散在的微小結(jié)節(jié)，需與原發(fā)性和(或)粟粒性肺結(jié)核相鑒別或存在伴發(fā)肺結(jié)核[25]；還有部分患者可見(jiàn)胸腔積液, 常伴有胸膜下肺結(jié)節(jié)，免疫功能低下者多見(jiàn)。

3.2隱球菌腦炎或腦膜腦炎CT 表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，即可無(wú)異常，也可表現(xiàn)為雙側(cè)大腦半球和(或)基底節(jié)的腦實(shí)質(zhì)不規(guī)則低密度和(或)高密度灶，腦膜強(qiáng)化，腦水腫及腦室擴(kuò)大等[26]。MRI在小型、輕度病變的部位、范圍、類型和評(píng)估嚴(yán)重程度及預(yù)后方面均優(yōu)于CT檢查[27-28]。MRI可表現(xiàn)為[29-30]：①平掃未發(fā)現(xiàn)異常，或出現(xiàn)腦溝、腦池線狀強(qiáng)化；②軟腦膜強(qiáng)化，最常見(jiàn)；③脈絡(luò)膜炎和室管膜炎，可見(jiàn)多發(fā)斑片狀或片狀的長(zhǎng)T1長(zhǎng)T2信號(hào)(雙側(cè)基底節(jié)及額、顳、頂葉)，增強(qiáng)掃描后病變呈片狀強(qiáng)化或無(wú)明顯強(qiáng)化；④肉芽腫，常見(jiàn)于雙側(cè)大腦半球，可見(jiàn)單發(fā)或多發(fā)類圓形T1WI呈低信號(hào)、T2WI呈高信號(hào)、增強(qiáng)后呈結(jié)節(jié)狀強(qiáng)化病灶，易誤診為肺癌腦轉(zhuǎn)移；⑤腦積水，可見(jiàn)輕至中度對(duì)稱性腦室擴(kuò)張，多見(jiàn)于疾病中晚期。

4 隱球菌抗原檢測(cè)

抗原檢測(cè)是臨床診斷隱球菌病常用方法，可用于多種標(biāo)本檢測(cè)，其靈敏性和特異性都較高，但不能區(qū)分基因型及隱球菌種類[31]。目前常用三種方法是：乳膠凝集試驗(yàn)法(latex agglutination test, LA)和膠體金試驗(yàn)法(lateral flow assay，LFA)以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。

4.1血清乳膠凝集試驗(yàn)法(latex agglutination test，LA) 是以乳膠顆粒為載體，連接抗隱球菌莢膜多糖抗體，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，當(dāng)?shù)味取?∶8時(shí)為陽(yáng)性診斷。LA具有快速、簡(jiǎn)便、有效、并且優(yōu)于鏡檢法和培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)，但免疫功能正常者陽(yáng)性率明顯低于免疫缺陷者。有研究證實(shí)，LA靈敏度和特異度分別為93%～100%和93%～98%，其診斷價(jià)值高，同時(shí)可評(píng)估療效和預(yù)后，但也存在假陽(yáng)性和假陰性[32-34]。有文獻(xiàn)報(bào)道，一些技術(shù)性問(wèn)題(洗滌反應(yīng)板被清潔劑及滑石粉污染標(biāo)本)和一些感染問(wèn)題(類風(fēng)濕因子、巨球蛋白、毛孢子菌屬、曲霉菌和抗酸桿菌等的抗原易被誤檢測(cè)為莢膜多糖抗原)可導(dǎo)致試驗(yàn)假陽(yáng)性，但假陽(yáng)性率較低，約為1%[16]。但有研究顯示，標(biāo)本經(jīng)鏈霉蛋白酶和二硫蘇糖醇處理后，可以消除類風(fēng)濕因子等干擾因子的干擾。而鉤帶現(xiàn)象(鉤帶現(xiàn)象是指抗原與抗體濃度比例不合適而導(dǎo)致凝集反應(yīng)不明顯)和體內(nèi)一些非特異性蛋白可掩蓋隱球菌抗原反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性[35]。所以當(dāng)只有單一的LA陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，不能草率的診斷隱球菌感染，需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他實(shí)驗(yàn)室檢查以診斷。但有人認(rèn)為，免疫正常者LA陽(yáng)性提示可能存在播散性感染[36]。

4.2膠體金試驗(yàn)法即CrAg橫向流動(dòng)測(cè)定法(lateral flow assay，LFA)，是一種夾心免疫層析試紙條試驗(yàn)。LFA具有標(biāo)本處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)方法快速(<15分鐘)，結(jié)果易讀等特點(diǎn)，可用于隱球菌感染高危者及HIV患者的預(yù)防性抗真菌治療前的篩查[37]。LFA與LA及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等的靈敏度及特異度高度一致，其還可檢測(cè)到一些其他血清學(xué)方法檢測(cè)為陰性的格特隱球菌[34,38-39]。但LAF檢測(cè)也存在假陰性和假陽(yáng)性，比如疾病早期、血清抗原較少、溶血的血清樣本、極高濃度的抗原(>0.140 mg·mL-1)等均可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，如果在出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性，而又不除外前帶現(xiàn)象(前帶現(xiàn)象是指LFA檢測(cè)極高濃度的隱球菌抗原時(shí)，出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性)時(shí)，可進(jìn)行半定量滴度檢測(cè)來(lái)排除假陰性[35]。隱球菌與曲霉菌存在交叉反應(yīng)，可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，將標(biāo)本稀釋后檢測(cè)可降低假陽(yáng)性率。此外，LAF的靈敏度和特異度與檢測(cè)標(biāo)本關(guān)系密切，血清和腦脊液標(biāo)本靈敏度可達(dá)100%，特異度高達(dá)98%，但尿液標(biāo)本靈敏度為70.7%～92%[40-41]。

4.3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 以檢測(cè)隱球菌抗原和抗體滴度進(jìn)行診斷，也可評(píng)估病情轉(zhuǎn)歸，即抗體滴度升高提示病情好轉(zhuǎn)。其靈敏度及特異度與前兩種抗原檢測(cè)相當(dāng)，并也存在假陽(yáng)性和假陰性[35,38-39]。既往隱球菌感染，隱球菌呼吸道定值均可導(dǎo)致假陽(yáng)性。有研究顯示，ELISA檢測(cè)不同的標(biāo)本陽(yáng)性差異較大，尿液標(biāo)本比血清或血漿陽(yáng)性率低22倍。對(duì)于隱球菌孤立性病灶者，外周血或血清抗原檢測(cè)常為陰性，但檢測(cè)出高滴度陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，常意味著深部組織侵襲或存在播散可能。

5 病理學(xué)檢查

病理學(xué)檢查是診斷隱球菌病的金標(biāo)準(zhǔn)。典型的病理學(xué)特征為：可見(jiàn)小膿腫和凝固性壞死的非干酪性肉芽腫形成或形成趨勢(shì)，或膠樣病變。隱球菌菌體周圍存在大于菌體1～3倍的莢膜，被常用各種染色方法檢出[42]：墨汁染色、蘇木精-伊紅(HE)染色(因經(jīng)驗(yàn)不足易導(dǎo)致漏診)、過(guò)碘酸.雪夫(PSA)染色、六胺銀染色(MGS)、奧爾辛藍(lán)(AB)染色和黏液卡紅(MC)染色等。有研究顯示[43]，PSA、MGS和AB染色對(duì)隱球菌的陽(yáng)性檢出率分別為100%、97.4%和66.7%，但其他真菌感染時(shí)也顯示陽(yáng)性，則缺乏特異性[44]。而MC染色特異性最好，一般MC染色陽(yáng)性，可確診隱球菌病，但不能檢測(cè)出干性隱球菌，易出現(xiàn)假陰性，而黑色素可使干性隱球菌著色，所以當(dāng)MC染色陰性時(shí)，可加做黑色素染色以鑒別[45]。有研究顯示，無(wú)論是新鮮標(biāo)本還是甲醛固定的標(biāo)本，電子顯微鏡對(duì)隱球菌莢膜的檢出率較高，約85%，但其費(fèi)用較高，一般應(yīng)用于科研實(shí)驗(yàn)研究[34-35]。雖然病理檢查是隱球菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍容易誤診或漏診，這是與標(biāo)本取材(樣本較小，取材切面等)、真菌染色技術(shù)和病理醫(yī)生對(duì)隱球菌的警惕性不夠息息相關(guān)。

6 分子生物技術(shù)

近年來(lái)，分子生物技術(shù)在隱球菌分類、基因分型和診斷等研究中發(fā)展迅速，如染色體脈沖電泳、核酸探針技術(shù)、DNA指紋分類、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及PCR結(jié)合其他技術(shù)等方法[46]。目前，PCR技術(shù)運(yùn)用較多，因其具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，但特異性較低，而PCR實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)可彌補(bǔ)這一不足，但其擴(kuò)增效率的高低會(huì)直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。DNA探針技術(shù)可以對(duì)菌株變種分型，并進(jìn)行DNA指紋分類，可運(yùn)用核酸定位追蹤以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，但其不能區(qū)分活菌與死菌。PCR指紋和多位點(diǎn)序列分型(MLST)可以鑒定隱球菌基因分型[9,47]，而且多位點(diǎn)微衛(wèi)星分型(MLMT)可以進(jìn)一步區(qū)分MLST鑒定為基因分型相同的菌株[48-49]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，下一代多位點(diǎn)序列分型(NGMLST)和分析軟件程序(MLSTEZ)可實(shí)現(xiàn)高效、經(jīng)濟(jì)、高通量的多位點(diǎn)測(cè)序分型[50]，對(duì)流行病學(xué)調(diào)查研究和開發(fā)針對(duì)不同基因型進(jìn)行特異性治療以及隱球菌耐藥與基因型是否相關(guān)等研究具有重要意義。

7 總結(jié)與展望

總之，目前診斷隱球菌感染首先通過(guò)一般實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查進(jìn)行初步篩查，再以檢測(cè)隱球菌抗原抗體的免疫學(xué)檢查進(jìn)行診斷，而病理診斷仍為目前診斷隱球菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。分子生物技術(shù)可對(duì)隱球菌進(jìn)行基因分型等。但我們目前缺乏對(duì)隱球菌早期感染的特異性診斷方法，而且缺乏鑒定格特隱球菌感染的診斷技術(shù)，常導(dǎo)致臨床格特隱球菌感染的漏診。此外臨床診斷不能區(qū)分隱球菌感染的種類、基因分型，不能在疾病早期明確診斷，從而不能早期進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)、降低死亡率。為此，我們應(yīng)該增強(qiáng)對(duì)隱球菌感染的認(rèn)識(shí)，特別是HIV陰性隱球菌感染和格特隱球菌感染，并且開發(fā)對(duì)各種/各型的隱球菌早期或潛伏感染的特異性診斷方法，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而提高治愈率，降低死亡率。