耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥機制及檢測方法研究進展*

李雪寒 綜述，李一榮 審校

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430071)

金黃色葡萄球菌常定植于皮膚和鼻腔，致病能力強，能導(dǎo)致皮膚軟組織感染、中耳炎、心內(nèi)膜炎及菌血癥等多種感染。20世紀40年代初期，青霉素G應(yīng)用于臨床后顯著改善了金黃色葡萄球菌感染的治療療效。但是，1942年，臨床上就發(fā)現(xiàn)了耐青霉素G的金黃色葡萄球菌。1959年，為治療耐青霉素G的金黃色葡萄球菌感染，臨床上引入了甲氧西林，一種半合成的耐青霉素酶的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，它對產(chǎn)青霉素酶金黃色葡萄球菌有良好的殺傷作用。1961年，JEVONS在英國首次證實了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在，此后，臨床上MRSA菌株的檢出率逐年增長。到1985年，MRSA開始出現(xiàn)暴發(fā)性流行，成為全球院內(nèi)感染的首要病原體。在2011年，僅在美國一個國家，MRSA就造成了超過8萬例的侵襲性感染[1]。MRSA感染的高發(fā)生率和死亡率已經(jīng)導(dǎo)致巨大的社會和經(jīng)濟損失。現(xiàn)就MRSA的流行狀況、耐藥機制和檢測方法等研究進展做一綜述。

1 MRSA的流行狀況

自1961年首株MRSA發(fā)現(xiàn)以來，臨床上MRSA的檢出率逐年升高，到20世紀80年代后期，MRSA已成為全球發(fā)生率最高的院內(nèi)感染病原菌之一。在印度，1999年MRSA的檢出率已達80.8%，到2004-2006年，更是增長到了86.5%[2]。在歐洲的羅馬尼亞，2015年，MRSA的檢出率達到57.2%[3]。還有一些地區(qū)，MRSA的檢出率雖然不高但呈持續(xù)增長趨勢。例如澳大利亞，MRSA的檢出率由2000年的12.0%上升到2013年的19.0%。在歐洲的塞浦洛斯和斯洛伐克，MRSA的檢出率從2012年的35.2%和21.7%分別上升到了2015年的43.4%和28.1%[4]。在我國，從2005年中國細菌耐藥性監(jiān)測開始以來，在檢出的革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌所占比例一直都是第1位，在33.0%左右波動，而MRSA又是耐藥性金黃色葡萄球菌中最常見的。雖然自2005年以來，我國的MRSA檢出率處于下降趨勢，但局部區(qū)域的MRSA檢出率依然在70.0%以上[5]。

20世紀90年代以來，MRSA 所致感染的流行病學(xué)發(fā)生了顯著的變化，不僅局限于醫(yī)院內(nèi)，而且呈現(xiàn)出向院外蔓延的趨勢，于是提出了MRSA的兩種分型，即醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)和社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)。HA-MRSA通常引起住院、免疫力低下或老年患者的感染，這類人群一般是有手術(shù)史、經(jīng)常接觸醫(yī)院衛(wèi)生設(shè)施以及接受抗菌藥物治療的患者。而CA-MRSA則在社區(qū)間相互傳播，傾向于感染健康的年輕人，這些人在發(fā)病前與醫(yī)療機構(gòu)無任何接觸。美國德克薩斯州的研究表明,大約70.0%的社區(qū)獲得性金黃色葡萄球菌的感染均是CA-MRSA[6]。此外，CA-MRSA也可以引起醫(yī)院感染的暴發(fā)，這可能是由于CA-MRSA可以產(chǎn)生殺白細胞素(PVL)造成的[7]。細菌和患者在社區(qū)和醫(yī)院間不斷流動,相互傳播,導(dǎo)致了復(fù)雜的MRSA流行狀況。

2 MRSA的耐藥機制

2.1葡萄球菌染色體mec基因盒元件(SCCmec)的基本結(jié)構(gòu)和功能 金黃色葡萄球菌通常是通過獲得SCCmec而產(chǎn)生對甲氧西林的耐藥性。SCCmec為可移動遺傳元件，能在葡萄球菌屬內(nèi)菌株間轉(zhuǎn)移。SCCmec的大小為21～67 kb，具有高度多態(tài)性。目前，世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)11 種 SCCmec(Ⅰ～Ⅺ型)。雖然不同類型的SCCmec的大小和基因組成有所差異，但仍具有以下共同特征[1]：(1)攜帶一個mec基因復(fù)合體，由mec基因及其調(diào)控系統(tǒng)組成,與MRSA耐藥相關(guān)的mec基因為mecA和mecC。(2)攜帶一個ccr基因復(fù)合體，由位于復(fù)合體中央的ccr基因和相鄰的7～8個開放閱讀框(ORFs)組成，其中ccr基因包括ccrA、ccrB和ccrC[8]。ccr編碼的重組酶ccrAB或ccrC具有位點特異性，能識別相對應(yīng)的SCCmec元件，使之從葡萄球菌染色體中精確地分離，并通過轉(zhuǎn)移整合到其他葡萄球菌的菌株中，從而實現(xiàn)SCCmec在葡萄球菌屬內(nèi)菌株間轉(zhuǎn)移[9]。如ccrB結(jié)合attB和attS序列能完成SCCmec的剪切或整合，而ccrA盡管不直接參與SCCmec的剪切或整合，但起到促進ccrB對序列的識別作用，因而ccrA和ccrB總是成對出現(xiàn)。而ccrC單獨出現(xiàn)即可完成SCCmec的剪切或整合[1]。(3)SCCmec在orfX基因(編碼rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶)3′端的attB序列處整合入金黃色葡萄球菌染色體組，且SCCmec的插入對orfX的表達沒有影響。此外，SCCmec元件還含有3個J區(qū)域，主要起連接作用，也可能攜帶一些其他的抗菌藥物耐藥決定簇，如轉(zhuǎn)座子Tn554(編碼對紅霉素的耐藥)、質(zhì)粒pT181(編碼對四環(huán)素的耐藥)、質(zhì)粒pUB110(編碼對氨基糖苷類的耐藥)等基因元件。J區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異性是SCCmec分型的依據(jù)[10]。

2.2mecA基因介導(dǎo)的耐藥機制 mecA大小為2 129 bp,位于Ⅰ～Ⅹ型SCCmec上，編碼一種新的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a。PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的親和力很低。因此，PBP2a不受β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的影響，繼續(xù)發(fā)揮細胞壁黏肽合成酶的功能，催化細胞壁的合成，從而導(dǎo)致MRSA的產(chǎn)生[11]。mecA的表達受其相鄰的mecR1-mecI系統(tǒng)的調(diào)控，這個系統(tǒng)與金黃色葡萄球菌中調(diào)控β-內(nèi)酰胺酶表達的blaR1-blaI系統(tǒng)同源。mecR1編碼感受器蛋白MecR1，mecI編碼與MecR1相耦聯(lián)的抑制蛋白MecI。MecR1是一種金屬內(nèi)肽酶原，能通過胞外的青霉素結(jié)合區(qū)域感受到β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的存在。當β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結(jié)合到MecR1的感受器結(jié)構(gòu)域,MecR1被激活,其構(gòu)象發(fā)生改變，誘導(dǎo)胞內(nèi)感受器區(qū)域自動裂解，直接或間接導(dǎo)致MecI分裂，從而阻礙MecI結(jié)合到mecA啟動子區(qū)域,去除MecI對mecA的抑制作用,mecA開始表達,生成大量的PBP2a,使細菌產(chǎn)生耐藥性[1]。

2.3mecC基因介導(dǎo)的耐藥機制 2007年，在一項關(guān)于奶牛乳腺炎的研究中發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌菌株LGA251，它具有MRSA的表型，對苯唑西林和頭孢西丁耐藥，但是對mecA和PBP2a進行驗證時卻反復(fù)顯示為陰性。隨后對其作全基因組測序顯示，LGA251菌株攜帶一種新型的mecA同源基因，起初命名為mecALGA251，于2012年更名為mecC[12]。在此之后，在瑞典[13]、西班牙[14]、斯洛文尼亞[15]等地相繼發(fā)現(xiàn)mecC。mecC大小為2 198 bp，位于Ⅺ型SCCmec上，其核苷酸序列與mecA的同源性為69%。BALLHAUSEN等[16]用mecC敲除菌株(W44646ΔmecC)進行實驗，發(fā)現(xiàn)該菌株對頭孢西丁的最小抑菌濃度(MIC)值由16.00 μg/mL下降到4.00 μg/mL，對苯唑西林的MIC值由8.00 μg/mL下降到0.25 μg/mL。將敲除的mecC恢復(fù)后，菌株恢復(fù)對頭孢西丁和苯唑西林的耐藥性(MIC值上升為64.00 μg/mL)，從而證明了mecC與MRSA的形成有關(guān)。該研究還對mecA和mecC進行了對比研究，發(fā)現(xiàn)mecA和mecC的啟動子和操縱子的核苷酸序列也有所不同。mecA啟動子-10區(qū)域的序列為TAT ACT，而mecC該處序列為TAT TAT，該差異可能是導(dǎo)致mecA啟動子的活性在轉(zhuǎn)錄水平上高于mecC啟動子的原因。在MecI的結(jié)合位點處，mecA操縱子上包含一個30 bp的回文序列，由2個緊密相連的15 bp序列組成。而mecC操縱子上的回文結(jié)構(gòu)則被一個8 bp的連接肽分為兩段14 bp的序列。這些差異表明，mecC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)與mecA的存在差異。mecC的調(diào)控元件為mecISCCmecⅪ和mecR1SCCmecⅪ，分別編碼mecC轉(zhuǎn)錄抑制蛋白和感受器蛋白。其編碼的蛋白與MecI和MecR1同源性分別為66%和45%[16]。與mecA類似，mecC也編碼一種青霉素結(jié)合蛋白，稱為PBP2c。PBP2c與mecA編碼的PBP2a同源性為63%。KIM等[17]對PBP2c的性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)PBP2c具有藥物偏好性，相對頭孢西丁而言，其對苯唑西林的親和力更高，其對苯唑西林的親和力是PBP2a的4倍，因此表現(xiàn)為對頭孢西丁的高度耐藥，對苯唑西林處于中介耐藥甚至是敏感水平，而PBP2a則沒有這種現(xiàn)象。此外，兩者在熱穩(wěn)定性方面也表現(xiàn)出了差異，在37 ℃時PBP2a的活性最高且穩(wěn)定，而PBP2c則在25 ℃時表現(xiàn)出穩(wěn)定的高活性。

2.4fem基因介導(dǎo)的耐藥機制 除mecA、mecC之外，金黃色葡萄球菌染色體上還有一些基因也參與MRSA耐藥性的產(chǎn)生。這些基因一般與肽聚糖的合成、細胞的分裂和細胞壁的代謝相關(guān)。fem就是一種獨立于mecA和mecC的基因。與mecA和mecC不同，fem既存在于耐藥菌中，也存在于敏感菌中。敏感菌中的fem基因被滅活，可使菌株對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物敏感性提高。目前，已被確定的fem有6種：femA、femB、femC、femD、femE和femF。如femA和femB分別編碼FemA和FemB兩種胞質(zhì)蛋白，分別添加第2個和第3個甘氨酸殘基以及第4個和第5個甘氨酸殘基到細胞壁上的五甘氨酸肽間橋，從而參與細胞壁五甘氨酸肽間橋的形成。當femA和femB失活時,五甘氨酸肽間橋被單甘氨酸取代,使細胞壁肽聚糖成分發(fā)生改變，細菌對甲氧西林耐藥性降低[18]。femC是谷氨酰胺合成酶抑制因子，當femC失活時，谷氨酰胺合成酶基因(glnA)的轉(zhuǎn)錄減少,主干肽鏈的D-谷氨酸的酰胺化減少，從而使谷氨酰胺生成減少,使細菌細胞壁的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，細菌對甲氧西林的耐藥性降低。 femD編碼磷酸葡萄糖胺變位酶，催化葡萄糖-6-磷酸與葡萄糖-1-磷酸的相互轉(zhuǎn)化，femD失活會影響肽聚糖前體物質(zhì)的合成，使細菌對甲氧西林的耐藥性降低[19]。

3 MRSA的檢測方法

快速精準地檢測MRSA對臨床抗感染治療具有重要的作用。MRSA檢測方法較多，主要包括MRSA表型檢測(苯唑西林以及頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂篩選法、膠乳凝集法檢測PBP2a、顯色培養(yǎng)基法等)和MRSA耐藥基因檢測。2008年，美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)將頭孢西丁紙片擴散法列為MRSA的推薦檢測方法。2011年，DATTA等[20]比較了5種MRSA表型檢測方法的性能，證明頭孢西丁紙片擴散法為一種非常好的MRSA表型檢測方法，但他們認為還需要使用其他的方法作為補充來提高檢測的靈敏度。實驗數(shù)據(jù)顯示，乳膠凝集法的靈敏度為100.0%，特異度為99.2%，因此,推薦使用頭孢西丁紙片擴散法與乳膠凝集法聯(lián)合檢測。之后，F(xiàn)ARAHANI等[21]也通過實驗證明了頭孢西丁紙片擴散法是臨床首選的MRSA檢測方法。PCR法檢測mecA基因一直以來被認為是檢測MRSA的“金標準”。KOUPAHI等[22]對比了PCR法和4種表型檢測方法，結(jié)果顯示，頭孢西丁紙片擴散法和PCR法的靈敏度和特異度均為100.0%，苯唑西林紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法和顯色培養(yǎng)基法的靈敏度分別為95.45%、97.22%和98.13%，并認為頭孢西丁紙片擴散法可以在沒有分子檢測設(shè)備的情況下作為“金標準”的替代方法用于檢測MRSA。

臨床上對于MRSA的檢測主要是根據(jù)MRSA對苯唑西林和頭孢西丁高度耐藥的表型以及通過驗證mecA和PBP2a來判定的。但是，對于mecC MRSA，由于其對頭孢西丁高度耐藥而對苯唑西林敏感的表型以及mecA和PBP2a陰性，可能會將其誤判為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)。因此，在進行檢測時，選用頭孢西丁進行藥敏試驗比苯唑西林對mecC MRSA的檢測結(jié)果更準確[23]。當然，僅根據(jù)藥敏試驗結(jié)果檢測mecC MRSA是不夠可靠的。與傳統(tǒng)MRSA的檢測相似，應(yīng)用PCR技術(shù)驗證mecC是檢測mecC MRSA的“金標準”。STEGGER等[24]應(yīng)用多重PCR技術(shù)對185株金黃色葡萄球菌同時進行mecA和mecC的檢測，結(jié)果顯示靈敏度和特異度均為100%。此外，該項技術(shù)還能同時檢測PVL毒力基因和進行spa分型。PICHON等[25]應(yīng)用四重實時PCR技術(shù)同時檢測mecA、mecC、PVL毒力基因和nuc，此項技術(shù)不僅能精確檢測出4種基因，并且能將檢測時間縮短到1 h以內(nèi)，這為臨床上檢測MRSA提供了更為快速且全面的方法。BECKER等[26]利用Xpert MRSA Gen 3系統(tǒng)聯(lián)合PCR技術(shù)同時檢測mecA、mecC和SCCmec-orfX連接區(qū)域，這項技術(shù)大大增加了MRSA檢測的特異度。SEIDEL等[27]將核酸側(cè)流免疫分析(NALFIA)技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合用于檢測mecA和mecC基因來檢測MRSA。相對于普通PCR和實時PCR技術(shù)來說，PCR D核酸橫向流動免疫檢測技術(shù)有更精密的檢測限度，并可以區(qū)分mec的不同等位基因，且耗時較短，這使MRSA的檢測向著更精準快速的方向邁進。

4 總 結(jié)

MRSA被世界衛(wèi)生組織列入了2017年“重點致病菌”名單，其所造成的感染在今后相當長時間內(nèi)依然是棘手的全球公共衛(wèi)生問題。臨床微生物室通常使用紙片擴散法或顯色培養(yǎng)法來鑒定MRSA，但是由于mecA和mecC的基因序列與調(diào)控序列均存在一定差異，金黃色葡萄球菌體內(nèi)mecA和mecC表達的PBP2a和PBP2c結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的能力不同，從而呈現(xiàn)不同的耐藥表型。mecA介導(dǎo)的耐藥表型已引起高度關(guān)注，但mecC介導(dǎo)的耐藥表型(頭孢西丁耐藥/苯唑西林敏感或輕度耐藥)易被忽視甚至誤認為甲氧西林敏感，從而導(dǎo)致治療失敗。因此，了解MRSA的耐藥機制及其檢測方法，特別是mecC基因介導(dǎo)的耐藥機制及相應(yīng)的檢測方法，對于指導(dǎo)臨床抗感染治療具有重要意義。