腸道菌群及其代謝物TMAO與動脈粥樣硬化相關(guān)性的研究進(jìn)展*

李莉莎 綜述，胡瓊英，熊大遷△ 審校

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610072)

動脈粥樣硬化(AS)是導(dǎo)致心血管疾病(CAD)的主要原因之一，其與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積、內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷、單核細(xì)胞的黏附聚集、血小板的高反應(yīng)性以及并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。腸道菌群對人體健康的維持至關(guān)重要，主要參與機(jī)體的新陳代謝和免疫反應(yīng)等，能夠維持腸道結(jié)構(gòu)、保持腸道屏障的完整，其組成上的改變可以導(dǎo)致人體對不同疾病易感性的差異，與許多人類所患的常見慢性疾病相關(guān)，包括結(jié)腸炎、糖尿病、慢性腎病、自身免疫病和CAD等[1-2]。日常膳食為人類生活所必須，食物中的營養(yǎng)物質(zhì)包括肉堿、膽堿和甜菜堿等，在腸道菌群作用下，代謝形成三甲胺(TMA)，隨后轉(zhuǎn)化為氧化三甲胺(TMAO)[3]。越來越多的研究表明，腸道菌群參與的TMA/TMAO代謝途徑在AS發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中具有潛在的助推作用，提示TMAO可作為早期預(yù)測AS的潛在生物標(biāo)志物。本文整理了腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO在促AS發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，并簡要總結(jié)了以腸道菌群作為潛在治療靶點(diǎn)策略的最新進(jìn)展，尤其是天然藥物白藜蘆醇(RSV)在治療由TMAO升高而引起的AS中的積極作用，為之后針對個體腸道菌群的靶向治療提供新的思路和策略。

1 腸道菌群及其代謝物TMAO

腸道菌群是胃腸道特殊環(huán)境中1個數(shù)量龐大且多樣化的微生物群落。人類腸道菌群編碼基因超過500萬，包含300～3 000種不同的物種，其總數(shù)超過1013，與人體自身細(xì)胞數(shù)的比值約為 1∶1[4-5]。腸道菌群參與構(gòu)成腸道黏膜屏障并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，控制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，使宿主從膳食中獲取能量并將能量儲存在機(jī)體內(nèi)，協(xié)助免疫組織的成熟，防止病原微生物的繁殖。人類腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、螺旋菌門等組成[6]。在健康人體中，厚壁菌門和擬桿菌門占細(xì)菌總數(shù)的90%以上，其組成隨時間的推移趨于相對穩(wěn)定。影響腸道菌群組成改變的因素多種多樣，包括抗菌藥物的使用、病原體的感染、膳食習(xí)慣的改變等。在冠心病患者中，乳酸桿菌目以及厚壁菌門/擬桿菌門所占比例呈上升趨勢，而擬桿菌門(擬桿菌屬+普氏菌屬)則明顯下降[7]。

早期的研究證實(shí)，在AS斑塊中檢測到來自同1個體腸道中的細(xì)菌DNA[8]，說明腸道菌群能直接或間接地參與宿主AS的發(fā)生。后來的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群組成及其代謝途徑的改變與AS的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。這些改變的代謝途徑包括TMA/TMAO途徑、初級和次級膽汁酸途徑、短鏈脂肪酸途徑以及過分泌脂多糖等[9-10]，尤其是TMA/TMAO途徑，作為AS和心臟代謝疾病的潛在促進(jìn)劑，受到了廣泛的關(guān)注。

TMAO是一種直接存在于膳食中或者依賴于腸道菌群而產(chǎn)生的膳食代謝物。TMAO可直接存在于海魚類食物中，攝入的TMAO大約50%不經(jīng)機(jī)體作用直接隨尿液排出，其余50%則完成代謝逆轉(zhuǎn)過程[11]，即在腸道中經(jīng)TMAO還原酶轉(zhuǎn)為TMA，然后再次轉(zhuǎn)化為TMAO。此外，腸道菌群所特有的TMA裂解酶，能利用膳食中的碳源，將其轉(zhuǎn)化為TMA，隨后TMA被釋放入血液中，通過門脈循環(huán)進(jìn)入肝臟，在肝臟中被肝黃素單氧化酶3(FMO3)有效地吸收并迅速代謝氧化為TMAO[3]。

膳食中肉堿、膽堿和甜菜堿是膳食通過腸道菌群作用產(chǎn)生TMAO的重要碳源。(1)肉堿：大量存在于紅肉及乳制品中，與體內(nèi)脂肪代謝有關(guān)，肉堿有2個立體異構(gòu)型，即具有生物活性的L-肉堿和無生物活性的D-肉堿。MEADOWS等[12]發(fā)現(xiàn)腸道菌群包括黏質(zhì)沙雷氏菌和鈣乙酰不動桿菌等，能通過從L-肉堿中分離出3-氧丁?；a(chǎn)生TMA。(2)膽堿：膽堿是卵凝脂的組成部分，在蛋黃、奶酪和花生等中廣泛存在，是人類食物中常用的添加劑。膽堿能作為TMA的前體，在相關(guān)細(xì)菌酶的作用下生成TMAO。有學(xué)者在硫酸鹽還原菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了一種能降解膽堿的膽堿利用基因簇，由其所編碼的甘氨酸自由基酶CutC/D，能通過使膽堿的C-H鍵斷裂而催化膽堿降解為TMA和乙醛[13]。(3)甜菜堿：甜菜堿主要存在于麥麩、麥胚和蔬菜等食物中，同時也可以在人體腸道細(xì)菌作用下，通過氧化膽堿或肉堿而被合成。WOOD等[14]發(fā)現(xiàn)甜菜堿可通過去甲基化，在甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)甲基酶催化下生成二甲基甘氨酸，二甲基甘氨酸脫羧后被代謝為TMA，最終生成TMAO，對機(jī)體產(chǎn)生促AS作用。日常膳食占據(jù)了人類生活的大部分，以上這些發(fā)現(xiàn)都為了解膳食如何通過腸道菌群產(chǎn)生促AS作用提供了新的研究思路，且能依此研發(fā)具有抑制TMA/TMAO相關(guān)代謝酶類作用的靶點(diǎn)藥物，使針對ACD患者的個性化療法更具現(xiàn)實(shí)意義。

為了證實(shí)腸道菌群組成的變化及其代謝物TMAO的促AS作用，研究人員對AS易感小鼠給予膽堿刺激，顯示血漿循環(huán)TMAO水平以及相關(guān)特異性菌群比例同時增加，且各組血漿TMAO濃度與小鼠AS斑塊大小呈正相關(guān)。然而，在經(jīng)過抗菌藥物處理后，發(fā)現(xiàn)小鼠血漿循環(huán)TMAO減少并伴隨著AS的改善[15]。相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)也產(chǎn)生了類似的結(jié)果，且在對患者使用抗菌藥物后，還發(fā)現(xiàn)主動脈斑塊中巨噬細(xì)胞數(shù)量的顯著減少。從這些觀察反映出，富含膽堿的食物、腸道菌群對TMAO的產(chǎn)生必不可少，TMAO水平的升高確實(shí)產(chǎn)生了促AS的作用。

2 TMAO促AS的病理機(jī)制

大量研究表明，AS發(fā)生最初主要涉及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成。隨后ox-LDL損壞血管內(nèi)皮細(xì)胞造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和活化，同時ox-LDL可被清道夫受體識別和內(nèi)化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積累和泡沫細(xì)胞的形成，最終導(dǎo)致血管AS[16]。所以，ox-LDL的形成、內(nèi)皮損傷和泡沫細(xì)胞的形成是AS發(fā)生的關(guān)鍵事件[17]。此外，持續(xù)的炎性環(huán)境易使動脈硬化斑塊不穩(wěn)定，斑塊一旦破裂就會釋放大量凝血物質(zhì)，在血小板的協(xié)助作用下形成局部血栓，因此，血小板的高反應(yīng)性也被認(rèn)為是AS導(dǎo)致血栓的高危因素[18]。而TMAO的升高和這些病理過程都有著復(fù)雜的聯(lián)系。(1)TMAO可調(diào)節(jié)膽固醇和淄醇的代謝。肝膽固醇7α羥化酶(CYP7α1)是膽汁酸的主要合成酶，膽固醇在膽汁中的轉(zhuǎn)運(yùn)需要膽汁酸的協(xié)助。因此，CYP7α1的缺乏會間接導(dǎo)致膽固醇在膽汁中轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙。而TMAO的升高會使CYP7α1的表達(dá)降低，繼而縮小膽汁酸池，使膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，在不改變總膽固醇的前提下，阻止膽固醇的外流使其在細(xì)胞內(nèi)堆積[19]，形成富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。(2)TMAO能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。TMAO可以通過促進(jìn)核因子κB通路磷酸化來促進(jìn)血管炎性反應(yīng)的發(fā)生[20]，包括激活絲裂原活化蛋白激酶和磷脂肌醇信號途徑。此外，BOINI等[21]和SUN等[22]發(fā)現(xiàn)TMAO也可以通過促進(jìn)NLRP3炎性體的形成和激活，釋放炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β和IL-18，造成內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷。(3)TMAO能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集。TMAO通過使血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)上調(diào)，增加單核細(xì)胞的黏附性，誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集以及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[20-23]，隨后單核細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞在受損組織處轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，吞噬ox-LDL繼續(xù)形成泡沫細(xì)胞，黏附堆積于小鼠主動脈壁形成AS斑塊(4)TMAO能增強(qiáng)血小板高反應(yīng)性從而加速血栓的形成。ZHU等[24]在對4 007例受試者為期3年的前瞻性研究中，鑒定得出15類菌群與小鼠血小板高反應(yīng)性相關(guān)，發(fā)現(xiàn)TMAO能夠通過增加胞內(nèi)貯存Ca2+的釋放刺激血小板活化，多種血小板激活劑都伴隨著TMAO水平的升高而增強(qiáng)，包括ADP、凝血酶、膠原和再生障礙性貧血等。

在AS發(fā)生早期，由于TMAO水平的升高與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積、內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷、單核細(xì)胞黏附聚集、血小板的高反應(yīng)性等關(guān)鍵事件密切相關(guān)，所以理論上TMAO可作為心血管損傷的生物標(biāo)志物，不僅可以用于預(yù)測早期AS及心血管不良事件的發(fā)生，同時也為臨床對于依賴腸道菌群治療AS的治療方法的研究提供了新的途徑。

3 治療策略

目前臨床上對于抗AS的治療方案較為單一，使用他汀類降脂藥是目前臨床上治療AS主要手段。但是他汀類藥物在沒有CAD(初級預(yù)防)人群中的使用所帶來的危害可能大于益處。所以，亟需針對性更強(qiáng)、安全性更高的治療AS措施。

(1)控制飲食，從代謝源頭限制肉堿、膽堿、甜菜堿等食物的攝入。(2)糞菌移植，增加功能菌群豐度。糞菌移植是將健康者體內(nèi)功能完整的腸道菌群導(dǎo)入到患者體內(nèi)，達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。糞菌移植的治療作用已經(jīng)在諸多臨床實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，也為各種疾病發(fā)生時相關(guān)微生物與宿主的相互作用提供了證據(jù)，這些疾病包括艱難梭菌感染、炎性腸病、糖尿病、CAD、癌癥等[25-26]。GREGORY等[27]研究發(fā)現(xiàn)，AS的易感性可通過腸道微生物移植傳播。所以，臨床上通過糞菌移植術(shù)重塑患者腸道菌群可能是改善AS的有效策略。(3)研發(fā)TMA/TMAO相關(guān)代謝酶類抑制劑。有學(xué)者預(yù)測并確定了一種Rieske型加氧酶/還原酶(CNTAB)及其相關(guān)基因簇，該基因簇被認(rèn)為參與了人類腸道菌群基因組中的肉堿代謝，CNTAB在腸道菌群利用肉堿代謝生成TMA的過程中發(fā)揮重要作用[28]。上文提及的膽堿特異性TMA產(chǎn)生酶，CutC/D，也能夠催化膽堿降解產(chǎn)生TMA[13]。此外，F(xiàn)MO3在TMA轉(zhuǎn)化為TMAO過程中發(fā)揮著不可替代的作用，MIAO等[29]通過敲除胰島素拮抗小鼠中FMO3基因，證實(shí)FMO3參與了全身膽固醇和甾醇代謝的調(diào)節(jié)。因此，可以將這些細(xì)菌代謝酶作為潛在治療靶點(diǎn)，通過人為干預(yù)控制相關(guān)酶，降低TMAO水平以減緩由相關(guān)膳食代謝所導(dǎo)致的AS發(fā)展。有趣的是，WANG等[30]在研究時發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中本身存在一種TMA裂解酶抑制劑，即膽堿結(jié)構(gòu)類似物3,3-二甲基-1-丁醇，它能夠通過抑制多種腸道菌群的TMA裂解酶，阻止膽堿或肉堿膳食經(jīng)腸道菌群代謝生成TMAO。(4)天然藥物-RSV。RSV作為一種天然的多酚，參與了機(jī)體脂肪代謝、葡萄糖平衡，具有抗炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等作用[31-32]。其有利于治療多種代謝紊亂性疾病，并且能通過重塑腸道菌群改善AS。CHEN等[33]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.4%的RSV治療能抑制TMA的合成，首次證明了RSV可以通過多種方式重塑腸道菌群，且其能利用調(diào)控腸道菌群的方式增加肝臟膽汁酸的合成和降低TMAO水平。RSV重塑腸道菌群包括降低厚壁菌門/擬桿菌門比率和增加益生菌的相對豐度[34]，益生菌可增加腸道膽汁酸水解酶活性，顯著上調(diào)CYP7α1的表達(dá)，促進(jìn)肝臟膽汁酸的合成，最終抑制TMAO的升高，從而達(dá)到改善AS、降低CAD患病風(fēng)險的目的。雖然將RSV作為一種針對性更強(qiáng)、安全性更高的抗AS藥物具有一定的理論基礎(chǔ)，然而由于其低生物利用度[35]，RSV用于臨床治療AS的有效性尚未確立，新型藥物的研發(fā)還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

因?yàn)槟c道菌群對TMAO的形成至關(guān)重要，所以可以將重塑腸道菌群以及抑制TMA/TMAO途徑作為治療策略，無論是通過膳食干預(yù)、糞菌移植來改善腸道菌群益生菌屬豐度，還是研發(fā)使用相關(guān)TMA裂解酶類抑制劑以及使用具有抗AS作用的天然藥物，都有可能改善因TMAO升高導(dǎo)致的AS。

4 問題與展望

盡管腸道菌群及其代謝物TMAO對于AS的助推作用已經(jīng)得到了很多動物模型、臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但是研究依舊面臨著許多挑戰(zhàn)。(1)膳食中的膽堿、肉堿和甜菜堿均能作為營養(yǎng)物質(zhì)，增加魚肉攝入比例，也可以減輕炎性反應(yīng)從而預(yù)防CAD。在一項(xiàng)隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)僅在伴有TMAO水平異常升高的群體中，膽堿、甜菜堿和肉堿水平才能預(yù)測主要不良心臟事件[31]。(2)并不是所有年齡段人群中TMAO的增高都會產(chǎn)生促AS作用。一組實(shí)驗(yàn)對象為33～45歲成年人的前瞻性實(shí)驗(yàn)表明，血漿TMAO的升高與AS進(jìn)展及CAD的發(fā)病率增加無關(guān)，TMAO可能對健康的中青年早期AS的風(fēng)險和進(jìn)展沒有顯著的影響[32]。(3)以上提到的病理機(jī)制中，TMAO是否直接與特定受體相互作用，或是通過改變蛋白構(gòu)象間接改變信號通路目前還尚不清楚，因此還需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)，以研發(fā)針對性更強(qiáng)的靶點(diǎn)藥物。

近年來，人類微生物組計(jì)劃的提出、生物信息學(xué)以及代謝組學(xué)等高通量技術(shù)的發(fā)展，使人們對腸道菌群組成及其代謝產(chǎn)物的改變在導(dǎo)致人體AS中的重要作用有了更深刻的認(rèn)識，其參與的TMA/TMAO代謝途徑能以多種方式參與AS的發(fā)生發(fā)展，人們可以通過調(diào)節(jié)TMAO產(chǎn)生過程中的各個環(huán)節(jié)來降低TMAO水平，既而阻止AS的發(fā)生發(fā)展。然而，由于相關(guān)微生物合成酶類以及TMAO在促AS過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不是十分明確，當(dāng)前鑒定得出的細(xì)菌種類也比較局限，所以腸道菌群在宿主代謝過程及AS進(jìn)展中的精確作用仍有待闡明?；仡櫼酝鶎τ谀c道菌群及其代謝物TMAO與AS關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)人們的認(rèn)識相對局限，缺少從整體上(如完成整個代謝過程、人體發(fā)育的完整階段以及病程的前中后期等)結(jié)合定性乃至定量地去權(quán)衡特定膳食攝入帶來的風(fēng)險是否超過益處。因此，需要大量多中心、大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)以更加全面地認(rèn)識腸道菌群組成的改變及其代謝過程與AS發(fā)生之間的相互作用關(guān)系，以期能發(fā)現(xiàn)更多的，能夠靶向產(chǎn)生TMAO的細(xì)菌或參與酶來證實(shí)其潛在的治療能力。