賴氨酰氧化酶樣蛋白2在肝纖維化及肝癌中的研究進(jìn)展

馮 蕾 孫學(xué)華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海市 201203，電子郵箱：fenglei1121@126.com)

【提要】 賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)是一種新的胺氧化酶，可催化膠原及彈性蛋白交聯(lián)，其過表達(dá)將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。大量研究表明LOXL2在肝纖維化和肝細(xì)胞癌肝臟細(xì)胞及組織中高表達(dá)，與肝纖維化的共價交聯(lián)及肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為一個良好的診斷指標(biāo)和治療靶點。本文就LOXL2與肝纖維化、肝癌的關(guān)系進(jìn)行綜述。

賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)于1997年因在正常衰老的人成纖維細(xì)胞中過度表達(dá)而被發(fā)現(xiàn)[1]，其為賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族成員之一。研究表明，抑制LOXL2的表達(dá)可以阻斷膠原和彈性蛋白的交聯(lián)，以減少各種細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉淀，被認(rèn)為可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化。LOXL2的過表達(dá)還與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、侵襲和腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)有關(guān)[2-3]。LOXL2可能成為未來肝纖維化及肝癌的治療新靶點，本文就LOXL2與肝纖維化、肝癌的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 LOX家族與慢性肝病的關(guān)系

LOX家族是一種銅依賴性氨基酸氧化酶，具有保守的C末端結(jié)構(gòu)域，可催化彈力蛋白和膠原纖維蛋白中賴氨酸殘基ε-氨基基團(tuán)氧化脫氨而產(chǎn)生肽基醛，形成催化膠原蛋白和彈力纖維的分子間共價交聯(lián)，這種交叉連接將膠原蛋白和彈性蛋白的可溶性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)中穩(wěn)定性較強(qiáng)的不溶性纖維，交織成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的作用[4-5]。LOX基因家族共有5個成員，包括LOX，LOXL1，LOXL2，LOXL3，LOXL4[6]。Vadasz等[7]采用原位雜交和免疫組化方法將正常肝臟組織、威爾森氏病和原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋切片處理，發(fā)現(xiàn)在威爾森氏病和原發(fā)性膽汁性肝硬化病中LOX和LOXL2呈高表達(dá)，并與肝細(xì)胞內(nèi)膠原沉積有關(guān)。Liu等[8]在四氯化碳誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肝纖維化模型中使用LOX抑制劑β-氨基丙腈6周后發(fā)現(xiàn)，小鼠表現(xiàn)出肝纖維化加速逆轉(zhuǎn)，同時LOX蛋白減弱了肝星狀細(xì)胞的活化，而β-氨基丙腈是一種不可逆的LOX抑制劑，LOXL2的胺氧化酶活性不受β-氨基丙腈的抑制，這表明LOXL2的結(jié)構(gòu)和親和力與LOX不同。銅是LOX蛋白的輔助因子，它會導(dǎo)致肝臟的損傷和瘢痕。威爾森氏病作為一種銅代謝紊亂性疾病，會使肝細(xì)胞內(nèi)LOX和LOXL2高表達(dá)從而導(dǎo)致進(jìn)行性損傷肝臟[9]。目前研究表明LOX和LOXL2可促進(jìn)纖維膠原Ⅰ的交聯(lián)，而纖維膠原Ⅰ是纖維細(xì)胞間質(zhì)和纖維化的主要組成部分；同時發(fā)現(xiàn)與LOXL2相比，LOX特異性藥物(M64)對由丙型肝炎或脂肪性肝炎引起的肝纖維化缺乏有效性，使其在肝纖維化治療期間的效果不顯著[10]。

2 LOXL2的結(jié)構(gòu)及功能

LOXL2是一種新的胺氧化酶，能夠催化膠原蛋白和彈性蛋白形成賴氨酸從而衍生為共價交聯(lián)[11]。膠原蛋白的聚合是器官纖維化的前提條件，研究表明，LOXL2被認(rèn)為是肝纖維化的關(guān)鍵蛋白[12]。LOXL2的氨基酸序列由一個n端信號肽相連的774個殘基組成，鄰近n-末端4個清道夫受體富含半胱氨酸(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)結(jié)構(gòu)域，SRCR結(jié)構(gòu)域是具有110個殘基的高度保守結(jié)構(gòu)域，用于細(xì)胞信號的傳導(dǎo)和黏附，重復(fù)的SRCR結(jié)構(gòu)域通過與細(xì)胞外基質(zhì)中的調(diào)節(jié)配體或蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)LOXL2的胺氧化酶活性[11]。雖然從氨基酸序列中預(yù)測的LOXL2基因分子質(zhì)量大約是84 kDa，但在最近一次研究中已經(jīng)確定了一個較小的細(xì)胞外65 kDa形式的分子量[13]，其基因定位于8號染色體p21.2-p21.3，大多數(shù)LOXL2基因外顯子-內(nèi)含子交界處氨基酸序列為(C/T)AG-外顯子-GT(A/G)，通過DNA序列分析，LOXL2與LOX有45%的同源性，與LOXL1有48%同源性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制LOXL1的活化對膠原蛋白影響不大，但可以有效減少彈力蛋白的交聯(lián)，限制肝硬化的進(jìn)展并抑制肝星狀細(xì)胞的活化，在肝纖維化階段LOXL2表達(dá)顯著增加，表明LOXL2可能與肝纖維化有關(guān)[10，15-16]。Barker等[17]發(fā)現(xiàn)LOXL2誘導(dǎo)了生長在膠原基質(zhì)上的成纖維細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，提示LOXL2通過參與局部黏著斑激酶/蛋白激酶B信號通路而激活成纖維細(xì)胞，激活的成纖維細(xì)胞可以表達(dá)更多的LOXL2，推動前饋循環(huán)，從而進(jìn)一步促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。抑制LOXL2介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化可減少腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不能減少原發(fā)性腫瘤細(xì)胞的生長。

3 LOXL2與肝病的關(guān)系

3.1 LOXL2與肝纖維化 肝纖維化是指慢性肝炎或肝損傷過度激活肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積是。肝纖維化進(jìn)展為肝硬化將引起嚴(yán)重并發(fā)癥，包括門脈高壓、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等，并導(dǎo)致較高的肝臟相關(guān)死亡率[18]。慢性肝病導(dǎo)致的肝纖維化是肝硬化的早期階段,而且肝纖維化的臨床癥狀常不夠典型。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，截至2015年，世界范圍內(nèi)約有2.57億HBV攜帶者，88.7萬人死于HBV導(dǎo)致的肝硬化；HCV攜帶者約7 100萬人，39.9萬人死于HCV導(dǎo)致的肝硬化[19]。肝纖維化主要是由肝臟的慢性炎癥和趨化因子、細(xì)胞因子的活性變化而引起的免疫細(xì)胞(特別是巨噬細(xì)胞)的浸潤和基質(zhì)表達(dá)細(xì)胞類型的增加。最近的臨床研究表明長期服用抑制HBV藥物的患者，肝纖維化甚至肝硬化可發(fā)生逆轉(zhuǎn)[20]。肝臟重塑瘢痕組織并且恢復(fù)到正常肝臟的能力遵循特定的機(jī)械原理，包括慢性組織損傷的終止、引發(fā)肌成纖維細(xì)胞凋亡或衰老、多余的瘢痕組織纖維蛋白溶解[21]。膠原交聯(lián)是纖維化的基本過程，細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)量化積累導(dǎo)致纖維化進(jìn)一步發(fā)展，同時限制肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。肝纖維化的特點是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增多，造成組織過度瘢痕化，促進(jìn)慢性肝損傷。而彈性蛋白降解的失敗是肝硬化中細(xì)胞外基質(zhì)積聚的重要因素[22]。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵[23]。近年來LOXL2在肝纖維化進(jìn)程中的作用得到廣泛的關(guān)注。Weiskirchen等[21]認(rèn)為LOXL2抑制劑即單克隆抗體(AB0023)是非常有效的肝纖維化和肺纖維化靶向藥物，LOXL2的表達(dá)受缺氧、轉(zhuǎn)化生長因子-β和microRNA(microRNA-26和microRNA-29)的影響，同時此藥正在進(jìn)行丙肝、原發(fā)性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的纖維化、肝硬化的2期臨床試驗。Ikenaga等[24]通過硫代乙酰胺誘導(dǎo)C57B1/6J小鼠肝纖維化模型，并采用特異性LOXL2單克隆抗體(AB0023)和特異性LOX單克隆抗體(M64)藥物分別治療6周，發(fā)現(xiàn)在AB0023治療組中纖維間隔變薄、細(xì)纖維增多，而M64治療組和安慰組則沒有變化，但是AB0023治療組早期干預(yù)時卻不能有效抑制肝纖維化，而是對于晚期肝纖維化的作用比較突出，且在纖維間隔中體現(xiàn)顯著優(yōu)勢；與安慰組比較，AB0023治療組小鼠的交聯(lián)膠原蛋白不溶解部分減少了45%，整體交聯(lián)膠原蛋白減少20.8%。目前的研究已闡明，抗-LOXL2抗體加速硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化的逆轉(zhuǎn)[21]。Dongiovanni等[25]在研究甲硫膽堿缺乏飲食的C57BL/6小鼠肝纖維化的發(fā)病機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，胰島素受體(InsR+/-)促進(jìn)肝纖維化，使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化受阻，患有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織中LOXL2水平上調(diào)。這些實驗表明，LOXL2在肝纖維化階段呈現(xiàn)出高表達(dá)，并且能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。此外Meissner等[26]對18例因HCV、艾滋病毒或同時感染HCV及艾滋病毒的晚期肝纖維化或肝硬化的患者使用持續(xù)22周的LOXL2單克隆抗體(Simtuzumab)藥物治療，結(jié)果顯示受試者耐受良好，且發(fā)現(xiàn)LOXL2單克隆抗體同時也會抑制金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，而金屬蛋白酶對抗纖維化進(jìn)程中膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的降解具有重要作用。Rosenbloom等[27]認(rèn)為LOX和LOXL2為判斷纖維化的發(fā)生和分期潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

3.2 LOXL2與肝癌 據(jù)統(tǒng)計，2012年肝癌全球發(fā)病率為0.1‰,在中國肝癌位居第二大常見癌癥，每年約有383 000人死于肝癌[28-29]。肝癌的發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及持續(xù)炎癥損傷，包括肝細(xì)胞壞死和再生，且與纖維化沉積相關(guān)[29]。Wu等[30]通過細(xì)胞四唑鹽比色法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷細(xì)胞染色法對體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)LOXL2對肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞)的增殖有影響，在HepG2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞中LOXL2 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，當(dāng)兩個細(xì)胞株感染LOXL2-siRNA時，LOXL2 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，沉默LOXL2基因?qū)⒁种艸epG2和SMCC-7721細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞集落形成，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，加速細(xì)胞的凋亡，表明LOXL2促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖，并且LOXL2在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中高表達(dá)。Barry-Hamilton等[10]發(fā)現(xiàn)LOXL2 mRNA在大多數(shù)實體腫瘤中高表達(dá)且其水平上調(diào)與腫瘤分級的增加有關(guān)，并且增加肝癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。Wong等[31]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1/SMAD4的激活使LOXL2水平顯著增高和microRNA-26/29的失活，導(dǎo)致LOXL2的過度表達(dá)。LOXL2在腫瘤組織和肝癌患者的血清中均有表達(dá)，表明LOXL2可能是肝癌一個良好的診斷標(biāo)志物。Wang等[32]將能穩(wěn)定表達(dá)短發(fā)夾RNA的HepG2細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞對抗含有低氧模擬劑氯化鈷的缺氧誘導(dǎo)因子-1后發(fā)現(xiàn)，低氯誘導(dǎo)因子-1α誘導(dǎo)LOXL2的上調(diào)，LOXL2高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)[33]。相關(guān)研究表明，通過抑制LOXL2表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，因此，LOXL2的高表達(dá)可作為肝癌的診斷依據(jù)及預(yù)后不良的評價指標(biāo)，也可能為抗癌藥物提供新的治療靶點[34]。

4 展 望

LOXL2抗體可以抑制膠原蛋白交聯(lián)，顯著減少膠原沉積，而膠原蛋白和彈力蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)的持續(xù)定量沉積的結(jié)果。LOXL2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路參與纖維化及腫瘤的進(jìn)展，抗肝纖維化及抗肝癌藥物研究的主要目標(biāo)是開發(fā)新的可靠的非侵入性方法，以取代纖維化或腫瘤評估中的肝臟活檢[35]。然而在臨床上仍存在諸多難題，如LOXL2抑制劑的毒副作用、療效是否確切等。隨著研究的深入，抑制LOXL2的活性可能是一種肝纖維化及肝細(xì)胞癌的有效治療方向。