高效液相色譜法測定中藥龍膽酊中龍膽苦苷的含量

欒慶祥，金曉峰，黃 鑫，楊 強，錢莘莘

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州貴陽 550003)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或滇龍膽的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)藥材之一，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1]。近年來，隨著現(xiàn)代中藥的發(fā)展，從龍膽中發(fā)現(xiàn)的化學成分已多達60余種，其多種成分具有一定的藥理活性作用[2-4]，研究表明龍膽苦苷為其主要活性成分，具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等活性[5-8]，是評價龍膽質量標準的首要指標[9]，并且在《中國獸藥典》2015年版中，龍膽苦苷作為中藥龍膽和其制劑龍膽瀉肝散質量標準控制的目標成分[10]。

龍膽酊是龍膽經加工制成的酊劑，具有健胃的功效，用于治療家畜食欲不振[11]?！吨袊F藥典》2015年版收載了該藥，但對該藥主要活性成分龍膽苦苷含量測定的方法沒有收載，為了彌補該標準的這一欠缺，筆者對中藥龍膽酊主要活性成分龍膽苦苷的含量測定進行方法研究，建立中藥龍膽酊中龍膽苦苷的含量測定方法，以期為完善中藥龍膽酊的質量標準提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器等(美國Agilent公司)；Waters 2695高效液相色譜儀，配四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器等(美國Waters公司)；ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱和XDB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱(美國Agilent公司)；XS105型和ME802E型電子天平(瑞士Mettler公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料與試劑龍膽苦苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110770-201013)；龍膽酊樣品(四川省川龍動科藥業(yè)有限公司提供，批號20130601-1、20130601-2、20130601-3；四川維爾康動物藥業(yè)有限公司提供，批號20131201、20131202、20131203)；甲醇為色譜純；乙醇、磷酸為分析純；試驗用水為超純水。

1.3方法

1.3.1色譜條件。流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(20∶80，V/V)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量10 μL。

1.3.2對照品溶液的制備和標準曲線繪制。精密稱取龍膽苦苷對照品適量，以甲醇為溶劑，配制成龍膽苦苷對照品溶液濃度為8 mg/mL。取濃度為8 mg/mL的龍膽苦苷對照品儲備液，用倍比稀釋法配制成系列質量濃度的溶液，分別為20、40、80、120、200和320 μg/mL，進樣10 μL，測定龍膽苦苷峰面積。以龍膽苦苷質量濃度(C)為橫坐標、相應峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3供試品溶液的制備。精密量取本品1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.4陰性樣品溶液的制備。精密量取40%的乙醇1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.5自制樣品溶液的制備。按《中國獸藥典》中龍膽酊的制法，制得龍膽酊，然后精密量取1 mL自制樣品，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3.6系統(tǒng)適用性和專屬性試驗。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“1.3.1”色譜條件測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應性。

1.3.7加樣回收率試驗。采用加標回收的方法，在已知含量的龍膽酊供試品中加入一定質量的龍膽苦苷對照品，使其制備后在供試品中加入龍膽苦苷的量為其含量的100%，平行制備6份。再按照“1.3.1”色譜條件測定峰面積，根據(jù)擬合的曲線方程外標法定量，計算出樣品中龍膽苦苷的測定量，加樣回收率=(測定量-已知量)/添加量×100%。取已知龍膽苦苷含量的龍膽酊樣品(批號20130601-1，含量為2.090 μg/mL)，平行量取樣品6份，每份精密量取樣品1 mL，并分別精密加入100%樣品含量的龍膽苦苷對照品，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機測定。

1.3.8精密度試驗。取供試品(批號20130601-1)溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣，重復進樣6次，測定龍膽苦苷的峰面積及其相對標準偏差(RSD)。

1.3.9耐用性試驗。取“1.3.7”項下制備好的樣品，保持流動相比例和流速不變，在Waters 2695和Agilent 1260高效液相色譜儀上分別使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱和Agilent XDB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱，于20、30、40 ℃條件下進行測試，考察方法的耐用性。

1.3.10穩(wěn)定性試驗。取同一對照品溶液，于制備后0、2、4、6、12、24 h注入液相色譜儀，按“1.3.1”色譜條件分別進行測定，記錄色譜峰面積，計算RSD。

1.3.11樣品測定。取不同批號的龍膽酊樣品和自制龍膽酊樣品，分別按“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機測定峰面積，根據(jù)擬合的曲線方程外標法定量，計算出樣品中龍膽苦苷的含量。

2 結果與分析

2.1系統(tǒng)適用性和專屬性試驗從圖1可以看出，龍膽苦苷峰分離度大于2.0，理論塔板數(shù)以龍膽苦苷峰計不低于要求的3 000，陰性樣品在與對照品和供試品色譜峰相同保留時間處無干擾峰。結果表明，處方中的其他成分對龍膽苦苷的定量測定無干擾，專屬性能滿足檢測要求。

圖1 對照品(a)、供試品(b)和陰性樣品(c)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance(a)，testing sample(b)and negative sample(c)

2.2標準曲線的繪制以龍膽苦苷質量濃度(C)為橫坐標、相應峰面積(A)為縱坐標，進行線性回歸，得出龍膽苦苷的回歸方程為A=11.5C-4.24(r=0.999 9)，表明龍膽苦苷在20～320 μg/mL線性關系良好。

2.3加樣回收率試驗從表1可以看出，龍膽苦苷回收率為95.6%～97.3%，平均回收率為96.4%，RSD為0.63%，表明該方法準確、可靠，可用于龍膽酊中龍膽苦苷的含量測定。

表1 龍膽苦苷加樣回收率試驗

2.4精密度試驗按照“1.3.8”方法操作，測定出龍膽苦苷的峰面積分別為472.46、472.38、471.77、471.46、471.60、471.48，其RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.5耐用性試驗按照“1.3.9”方法操作，結果發(fā)現(xiàn)該方法能夠耐受不同液相色譜儀、色譜柱、柱溫等因素的小范圍變化，測定龍膽酊中龍膽苦苷的含量無顯著差異，說明耐用性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗按照“1.3.10”方法操作，計算得出龍膽苦苷峰面積分別為472.46、471.60、472.67、473.40、478.53、472.11，RSD為0.54%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.7樣品測定按照“1.3.11”方法操作，結果發(fā)現(xiàn)20130601-1、20130601-2、20130601-3、20131201、20131202、20131203不同批號的龍膽酊樣品和自制樣品中龍膽苦苷的含量分別為2.090、2.036、2.040、1.525、1.527、1.529、2.197 mg，平均含量為1.849 mg。

2.8樣品含量限度根據(jù)“2.7”項下7批樣品中龍膽苦苷的含量實測值，計算出7批樣品的龍膽苦苷含量平均值為1.849 mg，按其平均含量的80%為龍膽酊中龍膽苦苷含量測定的含量限度，確定含量限度為每1 mL龍膽酊中含龍膽以龍膽苦苷(C16H20O9)計不得低于1.48 mg。

3 結論與討論

3.1含量測定成分的選擇龍膽酊是龍膽經加工制成的酊劑，所以龍膽為其主藥，《中國獸藥典》2015年版中龍膽及其制劑龍膽瀉肝散質量控制的目標成分均為龍膽苦苷，而龍膽苦苷也是龍膽的主要活性成分之一，因此龍膽酊中含量測定的成分選擇為龍膽苦苷。

3.2樣品前處理方法的選擇龍膽酊是龍膽最粗粉，用40%乙醇作溶劑，浸漬24 h后，按照滲漉法制得，因此樣品前處理方法相比提取龍膽原藥材要方便、簡單，參考《中國獸藥典》2015年版二部龍膽瀉肝散含量測定項下前處理方法進行樣品處理，結果表明該方法能夠較完全地提取出龍膽酊中的龍膽苦苷。

3.3色譜條件的優(yōu)化高效液相色譜法的流動相常以水相和有機相混合使用，該研究在參考相關文獻和《中國獸藥典》2015年版二部中龍膽瀉肝散含量測定的基礎上，分別考察了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.1%冰醋酸等不同流動相下龍膽苦苷的分離情況，結果表明，甲醇-0.2%磷酸和乙腈-0.2%磷酸作為流動相時分離效果好，無顯著差異，但是考慮到乙腈毒性大和使用成本高，故選擇甲醇-0.2%磷酸作為流動相；通過改變甲醇和0.2%磷酸比例，確定最佳洗脫條件，即甲醇-0.2%磷酸溶液(20∶80，V/V)等度洗脫，該條件下色譜峰峰型好，保留時間穩(wěn)定，能消除雜質峰的干擾，分離度達到要求。

采用高效液相色譜法測定龍膽酊中龍膽苦苷的含量，該方法簡單、快速、準確度高、重復性好，為完善中藥龍膽酊的質量標準提供了方法和依據(jù)，可以彌補《中國獸藥典》2015年版二部中沒有收載龍膽酊主要活性成分龍膽苦苷的含量測定方法，含量限度為每1 mL龍膽酊中含龍膽以龍膽苦苷(C16H20O9)計不得少于1.48 mg。