響應(yīng)面法優(yōu)化地骨皮多糖提取工藝

劉 濤，王 清，夏新奎，梁麗麗

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

地骨皮是枸杞的根皮，枸杞生命力頑強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，可以在干旱、鹽堿地生長(zhǎng)，但不宜在沼澤地生長(zhǎng),大多分布在我國(guó)華北、東北地區(qū)[1-2]。地骨皮的形態(tài)特征為：干燥的根皮呈短小的筒狀或槽狀卷片，表皮大多為灰黃色或棕黃色，有裂紋。地骨皮中主要包括有機(jī)酸類、黃酮類、酚類、多糖類等化學(xué)物質(zhì)[3-4]，常作為中藥藥材，性寒、味甘,具有降血壓，降血脂，清肺降火，保肝護(hù)肝等功效，如果能將地骨皮應(yīng)用到食品中，將會(huì)對(duì)人體健康大有裨益。

多糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水，通過(guò)糖苷鍵組成的碳水化合物，在自然界分布極廣，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌、延緩衰老、降血壓、降血脂、美容等許多生物功能。由于多糖是從生物體中提取，所以對(duì)人體的毒副作用小，多糖的應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣[5-7]。目前從中草藥中提取多糖已成為研究熱點(diǎn)，但對(duì)地骨皮多糖的提取和研究還很少。本文主要研究地骨皮多糖的提取，以便為地骨皮多糖的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

材料：地骨皮在信陽(yáng)中藥店購(gòu)買，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中藥教研室鑒定為中藥地骨皮。

試劑：葡萄糖，濃硫酸，苯酚，都為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器: TU-1810型紫外線分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，WK-4008高速藥物粉碎機(jī)(青州市(山東)精誠(chéng)機(jī)械有限公司)，LDZ4-0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，數(shù)顯提取恒溫鍋(北京精科華瑞儀器有限公司)，分析天平(國(guó)產(chǎn))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 多糖的提取工藝

地骨皮粉碎—熱水浸提—高速離心取上清液—減壓濃縮—加入5倍無(wú)水乙醇沉淀—加入丙酮、乙醚沉淀—干燥獲得地骨皮多糖[8]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(硫酸-苯酚法)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為K=5.3788c+0.0011，R2=0.9993，K是吸光度值，c為樣品的濃度。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)地骨多糖提取率的影響

稱取一定量粉碎后的地骨皮，在料液比、溫度相同的條件下，設(shè)置不同的時(shí)間梯度熱水浸提，離心后取上清液，然后測(cè)量不同時(shí)間下溶液的吸光度值。

2.3.2 提取溫度對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

稱取一定量粉碎后的地骨皮，在時(shí)間、料液比相同的條件下，設(shè)置不同的溫度梯度后熱水浸提，離心后取上清液，然后測(cè)量不同溫度下的溶液吸光度值。

2.3.3 液料比對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

稱取一定量粉碎后的地骨皮，在溫度、時(shí)間相同的條件下，設(shè)置不同的液料比后熱水浸提，離心后取上清液，然后測(cè)量不同料液比條件下溶液的吸光度值。

2.4 提取率的計(jì)算

樣品溶液的吸光度值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算可獲得對(duì)應(yīng)提取物的濃度，因此多糖提取率可按下面的公式計(jì)算：

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)優(yōu)化地骨皮多糖提取率的響應(yīng)面試驗(yàn)。依據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9-10]，通過(guò)建立多元二次回歸模型方程，用多項(xiàng)式對(duì)本試驗(yàn)中各個(gè)因素與指標(biāo)的相互關(guān)系進(jìn)行近似擬合，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析及各因素交互作用的響應(yīng)面圖形分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取時(shí)間對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

分別稱取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸餾水，70 ℃水浴恒溫條件下分別加熱1.5、2、2.5、3、3.5 h。每份溶液浸提后離心10 min(10 000 r/min)取上清液測(cè)量吸光度值。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 時(shí)間對(duì)地骨多糖提取率的影響

由圖1可知，在提取溫度、料液比一定的條件下，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí),地骨皮多糖的提取率達(dá)到最高點(diǎn)。在1.5～2.5 h過(guò)程中，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率增加。當(dāng)提取時(shí)間大于2.5 h后多糖提取率呈下降趨勢(shì)，原因可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)多糖發(fā)生一定程度的分解[11]，從而使多糖的提取率下降。

3.1.2 提取溫度對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

分別稱取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸餾水，提取時(shí)間設(shè)置為2.5 h，分別在50、60、70、80、90 ℃下水浴恒溫加熱。每份溶液浸提后離心10 min(10 000 r/min)取上清液測(cè)量溶液的吸光度值。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在提取時(shí)間、料液比一定的條件下，當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，地骨多糖的提取率達(dá)到最高點(diǎn)。在50～70 ℃的過(guò)程中隨著提取溫度升高，多糖的提取率增加。當(dāng)溫度大于70 ℃后多糖提取率呈下降趨勢(shì)。原因是溫度過(guò)高可導(dǎo)致多糖分解，隨著溫度的升高多糖的穩(wěn)定性降低[12]，從而使地骨皮多糖的提取率降低。

圖2 提取溫度對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

3.1.3 液料比對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

分別稱取5份3.0000 g地骨皮，加入90 mL蒸餾水。設(shè)置提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為2.5 h。液料比分別按15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1 mL·g-1水浴恒溫浸提后，離心10 min后(10 000 r/min)取上清液測(cè)量其吸光度值，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)地骨多糖提取率的影響

如圖3所示，在溫度、時(shí)間一定的條件下，液料比為25 ∶1 mL/g左右時(shí)地骨多糖的提取率達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)液料比在15 ∶1 mL/g到25 ∶1 mL/g的過(guò)程中提取率呈上升趨勢(shì)，因?yàn)殡S著液料比的增加，物料溶解的程度越來(lái)越大，物料溶解的程度越大，多糖的提取率也越大。當(dāng)液料比大于25 ∶1 mL/g時(shí)提取率呈平穩(wěn)趨勢(shì)，這表明液料比為25 ∶1 mL/g時(shí)多糖已經(jīng)基本提取完全。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化地骨皮多糖提取工藝

3.2.1 分析因素的選擇及分析方案

根據(jù)單因素地骨皮多糖提取工藝參數(shù)，可確定3個(gè)因素和3個(gè)水平進(jìn)行地骨多糖提取響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)。響應(yīng)曲面試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 模擬方程的建立

使用Design expert 8.0.6.0軟件對(duì)表2中地骨皮多糖提取率多元回歸擬合，得回歸方程為

K=16.78-1.13A+0.57B-0.078C+0.35AB-

0.67AC-1.23BC-1.88A2-2.52B2-3.23C2

式中:K為地骨多糖的提取率(%);A表示提取溫度(℃)；B表示提取時(shí)間(h);C表示液料比(mL/g)。

3.2.3 方差分析

為了檢驗(yàn)回歸方程是否有效，確定各因素對(duì)地骨皮多糖提取率的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,如表3所示。

方程的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)，說(shuō)明存在最大值。

表3 響應(yīng)面回歸方程的方差分析

注:*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)。

3.2.4 交互因素分析

兩兩因素交互作用對(duì)地骨皮多糖提取率影響的響應(yīng)面3D圖如圖4、圖5、圖6所示。

圖4 液料比和提取溫度對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

由圖4可知，提取溫度和液料比的交互作用構(gòu)成的響應(yīng)面圖有最高點(diǎn)。多糖的提取率隨著提取溫度和液料比值的變大先增加后減小。由曲面陡峭程度和P值可知液料比比提取溫度對(duì)多糖提取率的影響程度大。

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)當(dāng)液料比和提取時(shí)間同時(shí)增加時(shí)，地骨皮多糖的提取率也在增加。當(dāng)液料比達(dá)到25 ∶1左右和提取時(shí)間達(dá)到2.5 h左右時(shí)，地骨皮多糖的提取率達(dá)到最大。當(dāng)液料比大于25 ∶1，提取時(shí)間大于2.5 h時(shí)，隨著液料比和時(shí)間的增加，地骨皮多糖的提取率下降。由圖5曲線坡度的陡峭程度和表3的P值可知，液料比比提取時(shí)間對(duì)地骨皮多糖的提取率影響程度大。

圖5 時(shí)間和料液比對(duì)地骨皮多糖提取率的影響

圖6 時(shí)間和溫度對(duì)多糖提取率的影響

由6可知提取時(shí)間和提取溫度構(gòu)成的響應(yīng)面圖有最高點(diǎn)，即兩者有交互作用。多糖的提取率隨著提取時(shí)間和提取溫度值的變大先增加后減小，但由曲面的陡峭程度和表3的P值可以看出，提取溫度比提取時(shí)間對(duì)地骨皮多糖提取率的影響顯著。

3.2.5 試驗(yàn)的驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert8.0.6.0分析得到模型的極大值點(diǎn)為：液料比23.55 ∶1 mL/g、提取溫度70.91 ℃、提取時(shí)間2.5 h。最佳提取率為 16.9661%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)方案的有效性，設(shè)計(jì)了3組平行試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作取液料比24 ∶1 mL/g、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度71 ℃，由3組平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值得提取率為16.9020%。實(shí)際值與理論值相差0.38%，誤差較小。所以通過(guò)Design expert 8.0.6.0軟件得到的骨皮多糖提取率的回歸方程有效，具有參考價(jià)值。

4 結(jié)論

由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果可知，地骨皮多糖提取工藝的最佳條件為液料比是23.55 ∶1 mL/g、提取溫度為70.91 ℃、提取時(shí)間是2.5 h。最佳提取率為16.9661%。考慮到實(shí)際操作，取液料比24 ∶1 mL/g、提取時(shí)間2.5 h、溫度取71 ℃，由試驗(yàn)驗(yàn)證得提取率為16.9020%，多糖提取率實(shí)際值比理論值小0.38%，所以響應(yīng)面法優(yōu)化地骨皮多糖提取率工藝參數(shù)可靠有效。由方差分析得液料比的P值小于0.000 1，提取溫度的P值0.003，提取時(shí)間的P值0.5674。即這3個(gè)因素對(duì)地骨皮多糖提取率的影響程度為液料比最大，提取時(shí)間影響程度最小，提取溫度介于兩者之間。