下調(diào)G6PD表達對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制

任麗麗，張 然，古同男，吳常偉，陳 堅

1.首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院生化分子生物學教學實驗室，北京 101300； 2.北京市順義區(qū)醫(yī)院疼痛科；3.武警上海市總隊醫(yī)院腫瘤科

肝癌是實體瘤中預后極差的惡性腫瘤[1-2]。肝細胞具有生長增殖能力較強的特性，是肝癌患者預后不良的主要原因之一[3-5]。因此，尋找能顯著抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡的分子靶向標志物，成為臨床研究的重點。既往研究認為，腫瘤的發(fā)展過程涉及多個基因突變，在細胞的凋亡過程中起關(guān)鍵作用[6-7]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是磷酸戊糖途徑初始階段的第一個酶，同時也是磷酸戊糖途徑的限速酶。G6PD是由Xq28區(qū)域的管家基因編碼，廣泛表達于機體各種細胞中。在糖酵解過程中，G6PD可催化葡萄糖進入磷酸戊糖途徑，最終產(chǎn)生細胞活動所需要的能量。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，G6PD在腫瘤中高表達，可顯著促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。但G6PD在肝癌中的作用并不清楚，因此，本文通過下調(diào)G6PD在肝癌HepG2細胞中的表達量，觀察HepG2細胞增殖、凋亡的變化及初步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑和儀器肝癌HepG2細胞系、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國ThermoFisher公司，siRNA由上海吉瑪有限公司合成，MTT細胞增殖檢測試劑盒、BCA試劑盒、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自美國Promega公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體、G6PD抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體購自美國Abacm公司，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)抗體購自美國Santa Cruz公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。CO2生化培養(yǎng)箱、酶標儀購自美國Thermo公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Pharmacia Biotech公司。

1.2細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HepG2細胞培養(yǎng)于質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、質(zhì)量濃度為10 g/L雙抗的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2濃度培養(yǎng)箱中，其濃度為80%～90%，以1∶3進行傳代。選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞，分為對照組、siRNA陰性組、siRNA G6PD組。對照組為常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞，siRNA陰性組、siRNA G6PD組細胞采用LipofectamineTM2000分別將攜帶陰性對照和G6PD序列的siRNA轉(zhuǎn)染入細胞，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3轉(zhuǎn)染后細胞中G6PD蛋白的表達收集轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞，提取細胞中總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒所示進行蛋白定量。吸取25 μg蛋白，加入5倍體積的溴酚藍，100 ℃加入5 min，冷卻后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓調(diào)整至200 V，電泳至溴酚藍遷移至分離膠底部，停止電泳；然后將凝膠所攜帶的目的蛋白轉(zhuǎn)移至剪裁好的PVDF膜中，100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，置于5%封閉液中2 h；加一抗，轉(zhuǎn)鼓中孵育2 h，清洗，加二抗，轉(zhuǎn)鼓中孵育2 h，清洗，顯色，曝光，凝膠成像系統(tǒng)中拍照，與內(nèi)參GAPDH的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.4細胞增殖的檢測收集各組細胞，以每孔2×104個接種于96孔板，每孔加入20 μl MTT，37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，酶標儀中檢測細胞在570 nm的吸光值。

1.5細胞凋亡的檢測根據(jù)凋亡試劑盒說明書，細胞濃度調(diào)整為1×106ml-1，每孔設(shè)置4個復孔，加入10 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，避光，染色15 min，流式細胞儀計算細胞的凋亡率。

1.6細胞中凋亡相關(guān)蛋白的檢測根據(jù)1.3所示，檢測各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細胞中G6PD蛋白水平免疫印跡法(Western blotting)檢測轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞中G6PD蛋白的表達量，結(jié)果顯示，siRNA G6PD組細胞中G6PD蛋白的表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA陰性組與對照組G6PD蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖1、表1)。

圖1 轉(zhuǎn)染后細胞中G6PD蛋白水平Fig 1 The level of G6PD protein in transfected cells

組別G6PD蛋白水平對照組0.759±0.072siRNA陰性組0.748±0.076siRNA G6PD組0.351±0.033?F值40.359P值0.000

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2下調(diào)G6PD對細胞增殖的影響MTT檢測轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞的增殖狀況，結(jié)果顯示，siRNA G6PD組細胞的增殖顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA陰性組與對照組間細胞的增殖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 下調(diào)G6PD對細胞增殖的影響Tab 2 The effect on cell proliferation by down-regulating

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3下調(diào)G6PD對細胞凋亡的影響流式細胞儀檢

測轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞的凋亡狀況，結(jié)果顯示，siRNA G6PD組細胞的凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA陰性組與對照組間細胞的凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2、表3)。

圖2 下調(diào)G6PD對細胞凋亡的影響Fig 2 The effect on apoptosis by down-regulating G6PD

組別細胞凋亡率/%對照組5.362±0.634siRNA陰性組5.124±0.576siRNA G6PD組18.932±2.017?F值117.095P值0.000

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4下調(diào)G6PD對細胞凋亡蛋白水平的影響Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中凋亡蛋白的表達量，結(jié)果顯示，siRNA G6PD組細胞中Bcl-2蛋白的表達量顯

著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但Bax蛋白、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；siRNA陰性組與對照組間凋亡蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖3、表4)。

圖3 下調(diào)G6PD對細胞凋亡蛋白水平的影響Fig 3 Down-regulation of G6PD on apoptotic protein level

組別Bcl-2BaxCaspase-3Caspase-9對照組0.625±0.0660.214±0.0230.356±0.0320.451±0.041siRNA陰性組0.634±0.0610.225±0.0240.362±0.0380.425±0.043siRNA G6PD組0.285±0.023?0.527±0.056?0.674±0.064?0.856±0.082?F值41.39266.95145.36251.267P值0.0000.0000.0000.000

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

肝癌是一種惡性程度較高、進展快、預后極差的惡性腫瘤。近年來，隨著分子生物學研究的發(fā)展，越來越多的研究表明，肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴隨基因的突變、缺失或信號通路的改變[10-11]。G6PD是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶之一，可促進葡萄糖進入磷酸戊糖途徑，為細胞提供能量。腫瘤細胞發(fā)展過程中，細胞處于過度增殖的狀態(tài)，需要機體提供更多的能量，因此在腫瘤細胞中，G6PD的活性增強。研究表明，G6PD在多種腫瘤組織中表達量顯著增加，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等[12-15]，表明G6PD在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在本研究中，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將攜帶G6PD序列的siRNA轉(zhuǎn)染入肝癌HepG2細胞，Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA G6PD組細胞中G6PD蛋白的表達量顯著下降，表明轉(zhuǎn)染成功；MTT和流式細胞儀檢測下調(diào)G6PD的表達后HepG2細胞的增殖和凋亡狀態(tài)，結(jié)果顯示，下調(diào)G6PD后HepG2細胞的增殖顯著降低，凋亡率增加，表明G6PD表達量降低抑制HepG2細胞的增殖，促進其凋亡，G6PD在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因的作用。

細胞凋亡過程是一種由多種基因參與的細胞自主有序的死亡過程。研究表明，抑制細胞的凋亡、促進細胞增殖是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學基礎(chǔ)，而細胞的抑制凋亡作用是促進腫瘤發(fā)生的主要因素[16-18]。Bcl-2基因是Bcl-2家族中與細胞凋亡密切相關(guān)的癌基因，在細胞凋亡過程中發(fā)揮抑制凋亡的作用。研究證實，Bcl-2基因及其蛋白在細胞線粒體凋亡信號傳導通路中發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[19-20]。Bax也是Bcl-2家族的成員之一，在細胞線粒體凋亡信號傳導通路中發(fā)揮促進細胞凋亡的作用，一般與Bcl-2相互作用于線粒體膜中，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡。Caspase家族是細胞線粒體凋亡途徑中的重要蛋白因子。Caspase-9位于線粒體凋亡通路的上游，是細胞中重要的起始因子，在其他因子的作用下被活化并可激活凋亡通路下游的Caspase-3蛋白，促進細胞發(fā)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細胞的凋亡過程[21-22]。為進一步探究下調(diào)G6PD抑制細胞增殖、促進其凋亡的作用機制，本文檢測了各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的水平，結(jié)果顯示，siRNA G6PD組細胞中Bcl-2蛋白水平顯著下調(diào)，Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)，表明下調(diào)G6PD可能是通過調(diào)控HepG2細胞線粒體凋亡通路蛋白的水平，從而抑制細胞的增殖和促進凋亡。

綜上所述，下調(diào)G6PD通過調(diào)控線粒體凋亡通路，從而促進肝癌HepG2細胞的凋亡、抑制其增殖，阻礙肝癌的進一步發(fā)展，為肝癌的臨床治療和診斷提供理論依據(jù)和潛在靶點。