循環(huán)microRNA對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值的初步研究

趙西太， 聶青和， 龍振晝， 高祿化， 王媛媛

空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院傳染病科/全軍感染病診療中心，陜西 西安 710038

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，按照組織學(xué)類(lèi)型分為肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma，ICC)、混合細(xì)胞型肝癌，前者最為常見(jiàn)(占70%～90%)，也是本文重點(diǎn)討論的類(lèi)型。PLC是全世界第6位常見(jiàn)的惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因[1]，而中國(guó)國(guó)家腫瘤登記中心2015年數(shù)據(jù)表明，PLC為我國(guó)第4位常見(jiàn)和第2位致死的惡性腫瘤，年發(fā)病例數(shù)及死亡數(shù)約為46.6萬(wàn)和42.2萬(wàn)，約占全世界的50%，發(fā)病率和死亡率均明顯高于全球平均水平[2-3]。HCC的預(yù)后與臨床分期關(guān)系密切，巴塞羅那分期系統(tǒng)(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)0期及A期HCC采用治愈性療法手術(shù)切除、肝移植、射頻消融術(shù)等可獲得60%～80%的5年生存率，B期HCC患者中位生存時(shí)間僅2年左右，而C期、D期HCC除靶向治療藥物索拉非尼可有部分療效外，無(wú)其他治療方法可用，預(yù)后極差[4-6]。早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)給予適當(dāng)?shù)闹委熓翘岣逪CC總體療效的關(guān)鍵措施，也得到了多項(xiàng)臨床研究的支持[7]。HCC癌結(jié)節(jié)由肝動(dòng)脈及門(mén)靜脈雙重血供，病灶強(qiáng)化呈典型“快進(jìn)快出”，增強(qiáng)CT、增強(qiáng)MRI和超聲造影檢查的準(zhǔn)確性很高，是HCC臨床診斷的主要檢查方法[8-9]。不過(guò)，影像學(xué)檢查不易發(fā)現(xiàn)2 cm以下的小肝癌，且檢查費(fèi)用高昂，不適合用作HCC篩查和早期診斷[10]，而目前臨床上常用的腹部超聲和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)篩查敏感性及準(zhǔn)確性也不盡如人意[11-12]。

尋找靈敏、可靠而簡(jiǎn)便易行的HCC早期篩查方法臨床意義重大，也是目前研究熱點(diǎn)。大量HCC血清或組織標(biāo)志物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行臨床研究，有望成為可靠的HCC篩查和早期診斷的工具。微小RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)是其中的重要的部分[13]。miRNA是長(zhǎng)度為19～25核苷酸的單鏈非編碼RNA，序列高度保守，miRNA參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖/分化、細(xì)胞死亡、代謝等生物學(xué)過(guò)程，在基本生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，miRNA用于腫瘤早期診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后預(yù)測(cè)等的研究是熱門(mén)課題[15]。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)分析方法尋找PLC相關(guān)的循環(huán)miRNA，并探索其在PLC中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及資料收集收集2016年10月至2018年2月于空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院傳染病科住院確診為PLC、肝硬化的患者，并選擇部分無(wú)肝病患者作為對(duì)照。依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》和《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》診斷PLC和肝硬化[16-17]。本研究已獲空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，已告知入組患者其臨床樣本及病歷資料使用情況，并獲得同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PLC組患者要求年齡18～80歲，經(jīng)病理活檢或至少兩種影像學(xué)檢查(腹部超聲、超聲造影、平掃+增強(qiáng)CT、平掃+增強(qiáng)MRI)發(fā)現(xiàn)典型PLC表現(xiàn)，診斷明確；(2)肝硬化組患者要求年齡18～80歲，經(jīng)超聲、瞬時(shí)彈性成像、CT、MRI或病理學(xué)檢查確診肝硬化(失代償期或代償期)，病因包括慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等。對(duì)照組要求未患有慢性肝病及其他嚴(yán)重急慢性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)PLC組：患有轉(zhuǎn)移性肝腫瘤，合并其他部位惡性腫瘤、巨大肝囊腫/血管瘤，以及臨床診斷尚不明確、處于密切隨訪期的患者，均排除本研究觀察對(duì)象；(2)肝硬化組：合并其他部位惡性腫瘤，及不能明確排除PLC者，臨床高度懷疑有肝癌傾向者，均排除本研究觀察對(duì)象。

醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)中收集入組患者基本情況，包括性別、年齡、出院診斷、治療情況，及采血日前后輔助檢查、實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)資料，CT、MRI、超聲、AFP、HBV DNA定量、HBsAg、HBeAg、HBeAb、anti-HCV、HCV RNA定量、ALT、AST、血清白蛋白、膽紅素、WBC、PLT、RBC、血紅蛋白、尿素、肌酐、凝血酶原時(shí)間、INR等。

1.2PLC相關(guān)miRNA篩選利用miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase、miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRWalk 2.0、腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA等收集PLC相關(guān)miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出可用的目標(biāo)miRNA，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

1.3樣本收集及血漿miRNA表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.1 主要試劑：血清/血漿：miRNA提取分離試劑盒(DP503)、miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR211)、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)(FP411)購(gòu)自北京天根生化科技公司，PCR下游引物為試劑盒自帶的通用引物，PCR上游引物、外參照miRNA(cel-miR-39-3p)由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列如表1所示。

1.3.2 樣本收集及處理：5 ml乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝真空采血管晨起抽取入組患者靜脈血液約5 ml，立即混勻，30 min內(nèi)進(jìn)行血漿分離。簡(jiǎn)要步驟如下：取得血樣后離心，條件：815×g，10 min，4 ℃；上清液(血漿)轉(zhuǎn)移至15 ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中，再次離心，條件：2 500×g，10 min，4 ℃；二次離心后的上清液分裝至2 ml凍存管，液氮罐速凍約30 s，隨后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 miRNA-cDNA合成正向引物Tab 1 miRNA-cDNA synthesis forward primer

1.3.3 血漿miRNA提取及cDNA合成：血漿miRNA提?。喊凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，大致步驟如下：(1)樣品預(yù)處理：取200 μl待檢測(cè)血漿，加入900 μl裂解液MZA，旋渦振蕩器振蕩混勻30 s至完全勻漿，加入1 nmol/L的外參溶液5 μl，顛倒混勻，室溫放置5 min，加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻15 s，室溫放置5 min，13 400×g，4 ℃，離心15 min；(2)離心后液體分層，將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新離心管中并計(jì)量轉(zhuǎn)移液體積，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱miRelute，室溫放置2 min，13 400×g離心30 s，棄流出液，往吸附柱miRelute中加入700 μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，13 400×g離心30 s，棄廢液；(3)去蛋白處理后的吸附柱miRelute中加入500 μl漂洗液RW，室溫靜置2 min，13 400×g離心30 s，棄廢液，重復(fù)操作該步驟一次，再將吸附柱miRelute室溫13 400×g離心2 min，置于超凈工作臺(tái)上通風(fēng)片刻，以充分晾干；(4)干燥后的吸附柱miRelute轉(zhuǎn)入新的無(wú)酶離心管中，向吸附膜中心位置加15 μl無(wú)酶ddH2O，室溫放置2 min，室溫13 400×g離心2 min，重復(fù)該步驟一次，得到的miRNA溶液保存于-80 ℃。

cDNA合成：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在冰上預(yù)冷RNase Free的PCR反應(yīng)管內(nèi)加入2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μl、miRNA溶液8 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl，混勻，配制成20 μl反應(yīng)體系；反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)閙iRNA加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 ℃、60 min，酶失活反應(yīng)95 ℃、3 min，得到的cDNA溶液稀釋10倍，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 miRNA熒光定量檢測(cè)：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。20 μl反應(yīng)體系配制：2×miRcute Plus miRNA Premix (with SYBR&ROX)10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，miRNA第一鏈cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl。PCR反應(yīng)程序設(shè)置如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)程序設(shè)置Tab 2 PCR response program setting

1.4診斷試驗(yàn)PLC組與肝硬化組之間血漿表達(dá)有顯著差異的miRNA及AFP水平作為指標(biāo)，分別繪制PLC診斷的受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，考察ROC曲線下面積(area under theROC，AUC)、靈敏度、特異度、約登指數(shù)；miRNA及AFP兩兩或多指標(biāo)平行和系列診斷試驗(yàn)，計(jì)算其敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、約登指數(shù)；miRNA及AFP聯(lián)合診斷PLC，經(jīng)Wald逐步Logistic回歸法構(gòu)造回歸方程，計(jì)算每個(gè)PLC、肝硬化患者的預(yù)測(cè)概率，以預(yù)測(cè)概率作為指標(biāo)繪制PLC診斷的ROC曲線，計(jì)算上述診斷評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 6制作統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(最小值～最小值)表示，計(jì)數(shù)資料(二分類(lèi)及等級(jí)分類(lèi)資料)表示為率或頻數(shù)。計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析(各樣本獨(dú)立、來(lái)自正態(tài)總體，且各樣本的總體方差相等)，或非參數(shù)方法Tamhane’sT2和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD或Bonferroni法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般資料共納入85例確診患者。PLC組及肝硬化組患者病情相似，具有較好的可比性。3組白蛋白、ALT、尿素、肌酐、紅細(xì)胞、血紅蛋白比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其他病情指標(biāo)如膽紅素(P=0.466)、AST(P=1.000)、血小板(P=0.419),PLC組與肝硬化組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；患者年齡、性別構(gòu)成及其他臨床指標(biāo)AFP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PT、INR僅肝硬化組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 入組患者臨床資料(1)Tab 3 Clinical data of included patients

注：(1)大部分?jǐn)?shù)據(jù)樣本的總體分布呈現(xiàn)明顯偏態(tài)，統(tǒng)一描述為中位數(shù)(最小值～最大值)，其組間比較采用非參數(shù)方法Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間多重比較采用Bonferroni法。(2)其中1例缺乏臨床資料，除性別外的其他統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)自于7例對(duì)照。性別數(shù)據(jù)樣本的總體分布呈正態(tài)性，但方差不齊，其組間比較采用非參數(shù)方法Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間多重比較使用卡方分割法。與肝硬化組相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)；凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)；國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)。

2.2確定目的miRNA按照TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌組織miRNA表達(dá)情況，miRWalk 2.0靶基因預(yù)測(cè)，及c-Bioportal上PLC相關(guān)突變基因信息，結(jié)合文獻(xiàn)檢索情況，確定4條目的miRNA(見(jiàn)表4)。

表4 目的miRNA概況Tab 4 Objective miRNAs survey

注：*:截至2017年10月11日。

2.3目的miRNA的血漿表達(dá)情況與肝硬化組相比，PLC患者血漿中miR-10b-5p、miR-21-5p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028，0.004)；而miR-1258表達(dá)水平基本相同(P=0.985)，miR-1269a表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.223，見(jiàn)圖1)。

2.4miRNA對(duì)PLC的診斷價(jià)值

2.4.1 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP對(duì)PLC的診斷價(jià)值：三者的AUC分別為0.651(P=0.023，95%CI：0.529～0.774)、0.730(P<0.001，95%CI：0.615～0.846)、0.731(P<0.001，95%CI：0.619～0.844)；靈敏度分別為0.615(95%CI：0.446～0.766)、0.590(95%CI：0.421～0.744)、0.590(95%CI：0.421～0.744)，特異度分別為0.658(95%CI：0.487～0.804)、0.868(95%CI：0.719～0.956)、0.790(95%CI：0.627～0.905)；約登指數(shù)分別為0.273、0.458、0.379(見(jiàn)圖2)。以上3個(gè)指標(biāo)兩兩或三者一起進(jìn)行平行診斷試驗(yàn)和系列診斷試驗(yàn)，可顯著提高診斷的靈敏度或特異度(見(jiàn)表5)。

注：miRNA表達(dá)水平以目的miRNA與外參miRNA的Ct值之差，Ct表示其值越小，表達(dá)水平越高。圖1 4種目的miRNA血漿表達(dá)情況 A： miR-10b-5p; B: miR-21-5p; C: miR-1258; D: miR-1269aFig 1 Expressions of four kinds of objective miRNAs in plasma A: miR-10b-5p; B: miR-21-5p; C: miR-1258; D: miR-1269a

圖2 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP診斷PLC的ROC曲線Fig 2 ROC curve of miR-10b-5p, miR-21-5p, AFP in the diagnosis of PLC

2.4.2 多指標(biāo)聯(lián)合顯著提高診斷準(zhǔn)確性：嘗試使用miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258、miR-1269a和AFP共5個(gè)變量進(jìn)行PLC聯(lián)合診斷。經(jīng)Wald逐步Logistic回歸法篩選以后，miR-1269a被排除在方程外，其余參數(shù)可用于方程構(gòu)造(P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，模型χ2=43.386，P<0.001，Logistic回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Logistic回歸方程如下：

logitP=-0.766ΔCt(miR-10b-5p)-0.558ΔCt(miR-21-5p)+

0.55ΔCt(miR-1258)+0.003X(AFP)

其中l(wèi)ogitP為診斷為PLC與排除PLC(與肝硬化作對(duì)照)的概率之比的自然對(duì)數(shù)，即

logitP=ln[P/(1-P)]

表5 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP聯(lián)合診斷試驗(yàn)準(zhǔn)確性

注：OR表示平行試驗(yàn)，AND表示系列試驗(yàn)。

P為診斷試驗(yàn)中某一受試者被診斷為PLC的預(yù)測(cè)概率。根據(jù)以上公式,計(jì)算PLC組和肝硬化組共77例患者的預(yù)測(cè)概率，利用預(yù)測(cè)概率作ROC曲線，AUC=0.885(P<0.001，95%CI：0.811～0.960)，約登指數(shù)為0.639，敏感度和特異度分別為0.718(95%CI：0.551～0.850)、0.921(95%CI：0.786～0.983)(見(jiàn)圖3)。

圖3 Logistic回歸模型診斷PLC的ROC曲線Fig 3 ROC curve of Logistic regression model for diagnosis of PLC

3 討論

PLC主要危險(xiǎn)因素是肝硬化，其原因有慢性乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性、肝病自身免疫性肝炎、慢性藥物性肝損傷等[19-23]，另外，致癌物如黃曲霉毒素也導(dǎo)致大量的PLC患者[24]。我國(guó)有龐大的慢性乙肝、丙肝患者，整體發(fā)生PLC的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于世界平均水平，而預(yù)后并不理想，加強(qiáng)高危人群篩查、監(jiān)測(cè)，早發(fā)現(xiàn)、早治療PLC在我國(guó)尤其重要[2, 16]。目前每6個(gè)月至少一次的AFP和肝臟超聲檢查是主要的篩查手段，但敏感度較差，準(zhǔn)確度也不令人滿意，尤其對(duì)早期PLC，臨床呼喚更早期、更準(zhǔn)確的篩查方法[25]。有人嘗試?yán)酶斡捕戎当O(jiān)測(cè)PLC的發(fā)生，但目前僅有初步觀察性研究，尚需進(jìn)一步高質(zhì)量臨床研究驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值[26-27]。近年來(lái)，高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展催生了大量PLC血清學(xué)標(biāo)志物，目前有幾十種候選標(biāo)志物正在進(jìn)行臨床研究，包括miRNA[28]。

循環(huán)miRNA廣泛存在于人體多種體液(血液、尿液、唾液等)中，常包裹于外泌體內(nèi)或與蛋白結(jié)合，理化性質(zhì)穩(wěn)定，能夠抵抗血漿的內(nèi)源性核糖核酸酶，經(jīng)歷24 h室溫靜置或8次凍融后豐度幾乎不變，且有多種循環(huán)miRNA在PLC中表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，是十分理想的PLC血清學(xué)標(biāo)志物[29-30]。大量臨床研究證實(shí)，多種miRNA(miR-21、miR-122、miR-15b、miR-130b、miR-215等)表現(xiàn)出對(duì)HCC良好的診斷價(jià)值，具有誘人的臨床前景[31]。但循環(huán)miRNA診斷HCC的準(zhǔn)確性受多種因素影響，如miRNA表達(dá)模式(上調(diào)或下調(diào))、截?cái)嘀颠x擇、對(duì)照人群(慢性肝病或健康對(duì)照)、qPCR內(nèi)參基因(U6或其他)及樣本類(lèi)型(血清或血漿)等，選擇特異性好、區(qū)分度好、不同PLC患者中表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的miRNA，及多個(gè)miRNA聯(lián)合使用，對(duì)于提高PLC診斷效能十分重要[32]。

很多研究者使用高通量檢測(cè)方法(NGS和微芯片技術(shù))從肝癌細(xì)胞系或少量臨床患者癌組織、體液中篩選目的miRNA，用于后續(xù)分子機(jī)制或診斷試驗(yàn)等研究[33]。但該研究方法受樣本量小、假陽(yáng)性率高、費(fèi)用高昂等因素影響，不易得到有價(jià)值的miRNA，且PLC亞型眾多，小樣本篩選miRNA可能代表性不強(qiáng)，用于分子機(jī)制研究尚可，如果用于診斷或預(yù)后預(yù)測(cè)研究則可靠性大大降低。本研究使用生物信息學(xué)方法從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)掘PLC癌組織中差異表達(dá)的miRNA，在miRWalk 2.0分析其靶基因，進(jìn)而與c-Bioportal上發(fā)表的PLC相關(guān)高頻突變基因(>5%)相對(duì)比，靶基因與PLC相關(guān)高頻突變基因重合者定位目的miRNA；隨后在收集的PLC、肝硬化及對(duì)照者血漿中檢測(cè)上述miRNA表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b-5p、miR-21-5p在PLC患者血漿中表達(dá)水平偏高(P=0.028、0.004)，與其他同類(lèi)研究結(jié)果類(lèi)似[34-35]。而miR-1258表達(dá)水平基本無(wú)變化(P=0.985)，miR-1269a表達(dá)水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.223)，考慮除與其本身表達(dá)水平不穩(wěn)定、血漿豐度低以外，樣本量偏小可能也是重要原因。

我們收集PLC和肝硬化患者血樣進(jìn)行檢測(cè)，為使研究結(jié)論可靠，課題設(shè)計(jì)時(shí)強(qiáng)調(diào)排除可能患有腫瘤的病例?；加修D(zhuǎn)移性肝腫瘤，合并其他部位惡性腫瘤、巨大肝囊腫/血管瘤，以及臨床診斷尚不明確、處于密切隨訪期的患者，均排除PLC觀察對(duì)象。而肝硬化組不納入合并其他部位惡性腫瘤，不能明確排除PLC者，及臨床高度懷疑有肝癌傾向者，均排除入組病例。本診斷試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP單獨(dú)診斷PLC靈敏度及特異度均不甚理想，兩兩或三者進(jìn)行平行試驗(yàn)或系列試驗(yàn)可顯著提高靈敏度或特異度，但總體診斷效能無(wú)顯著提高?？紤]到miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258、miR-1269a及AFP與PLC具有相關(guān)性，應(yīng)用Logistic回歸分析Wald逐步回歸法篩選出可用參數(shù)miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258及AFP，構(gòu)造回歸方程，計(jì)算預(yù)測(cè)概率作為聯(lián)合診斷指標(biāo)，該診斷指標(biāo)的準(zhǔn)確性大幅上升。該研究尚有不足之處，篩選得到的miRNA數(shù)量偏少，可能不利于高診斷價(jià)值miRNA的發(fā)現(xiàn)；納入研究的病例較少，難以根據(jù)病情、并發(fā)癥、年齡、性別等因素進(jìn)行分層分析。

綜上所述，生物信息學(xué)方法篩選目的miRNA是簡(jiǎn)便易行且可靠程度高的方法，但TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的數(shù)據(jù)體現(xiàn)的是肝癌組織的miRNA表達(dá)情況，而血漿中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平有賴于肝癌組織產(chǎn)生外泌體、釋放miRNA數(shù)量的多與寡，因此，血漿miRNA水平與肝癌結(jié)節(jié)大小及壞死程度、轉(zhuǎn)移情況、治療方法等因素密切相關(guān)，篩選的miRNA臨床驗(yàn)證過(guò)程必不可少。單個(gè)miRNA診斷PLC準(zhǔn)確性欠佳，利用Logistic回歸法進(jìn)行多個(gè)miRNA聯(lián)合診斷可顯著提高診斷準(zhǔn)確性，可能成為miRNA診斷PLC的主要方法。