防控輸血傳播梅毒的篩查技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

龐 棟

（南寧中心血站，廣西 南寧 530003）

梅毒（Syphilis）作為一種性傳播疾病，可經(jīng)輸血傳播，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，可累及全身多個(gè)器官。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，每年約有1 200萬梅毒的新增病例，其中發(fā)展中國家占90%以上，更為重要的是，近30年調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)梅毒與HIV感染風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)［1-2］。采供血機(jī)構(gòu)通過對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行篩查、血液低溫保存、病原體滅活等技術(shù)，可防控輸血途徑傳播梅毒風(fēng)險(xiǎn)。本文就采供血機(jī)構(gòu)對(duì)經(jīng)輸血途徑傳播梅毒的防控技術(shù)，包括梅毒血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究進(jìn)展及其在獻(xiàn)血者篩查的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 輸血傳播梅毒的風(fēng)險(xiǎn)

輸血傳播梅毒的首個(gè)病例報(bào)道于1915年［3］，其后世界各國陸續(xù)有不少輸血傳播梅毒的案例報(bào)道。由于梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）對(duì)外界的抵抗力脆弱，對(duì)冷敏感，通常輸注保存于10℃以下、3天以上的血液制品傳播風(fēng)險(xiǎn)非常低［4］。在血液供應(yīng)緊張的欠發(fā)達(dá)國家地區(qū)，血液制品通常未在低溫保存3天以上，因此輸血傳播梅毒存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如我國現(xiàn)行血小板血液制品通常儲(chǔ)存在20～24℃，傳播梅毒風(fēng)險(xiǎn)可能更高。此外，近年調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)梅毒與HIV感染風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，HIV感染者常合并感染梅毒，故篩查獻(xiàn)血者梅毒螺旋體對(duì)防止輸血傳播梅毒非常關(guān)鍵［2，5］。美國采供血機(jī)構(gòu)對(duì)經(jīng)輸血途徑傳播梅毒防控效果顯著，1966年后少見輸血感染梅毒的案例報(bào)道［6］，此得益于采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行梅毒螺旋體嚴(yán)格篩查，屏蔽了陽性反應(yīng)獻(xiàn)血者，該措施發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其次，從低危人群中選擇無償獻(xiàn)血者、充足的血液供應(yīng)、血液經(jīng)冷藏等技術(shù)滅活也起到重要作用。然而，目前在亞洲和非洲等欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)梅毒等性傳播疾病仍廣泛流行，梅毒螺旋體感染的流行率仍達(dá)到25%［7］，血液安全面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。楊楠等［8］對(duì)2010—2014年蘭州地區(qū)獻(xiàn)血者進(jìn)行TP陽性分析，結(jié)果TP陽性率為0.49%。余桂華等［9］對(duì)2008—2011年云南曲靖地區(qū)獻(xiàn)血者調(diào)查分析，結(jié)果TP陽性率為0.60%。目前，世界衛(wèi)生組織（WHO）、國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）以及美國血庫協(xié)會(huì)（AABB）已提出預(yù)防輸血梅毒的策略，主要包括:選擇低危獻(xiàn)血者，并使用有效的實(shí)驗(yàn)室方法篩查；應(yīng)用病原體滅活技術(shù)；合理使用血液制品。對(duì)有高危行為的獻(xiàn)血者延遲或停止獻(xiàn)血，對(duì)于降低經(jīng)血傳播疾病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)窗口期的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

2 梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法可分為以下2種:血清學(xué)檢測(cè)和基于分子生物學(xué)的梅毒PCR檢測(cè)方法。

2.1 非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn) 該方法由August Von Wassermann于1906年首次報(bào)道［10］，主要包括性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）、未加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（USR）、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）和快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)（RPR）等，此類試驗(yàn)方法是基于梅毒感染后人體產(chǎn)生的IgM或IgG與非特異性心磷脂或卵磷脂發(fā)生顆粒狀凝集反應(yīng)判斷。非螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)早期在我國采供血機(jī)構(gòu)許可應(yīng)用于獻(xiàn)血者梅毒篩查，然而該法為非特異性血清學(xué)試驗(yàn)，受多種因素的影響發(fā)生交叉反應(yīng)，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，靈敏度和特異性較差，且需要人工肉眼判斷，不易于自動(dòng)化檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)記錄的保存。1997年起我國已經(jīng)取消了非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)用于獻(xiàn)血者血液篩查。

2.2 梅毒螺旋體特異性試驗(yàn) 梅毒螺旋體特異性試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是彌補(bǔ)了非密螺旋體試驗(yàn)的非特異性，目前常用的密螺旋體試驗(yàn)包括熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）、梅毒螺旋體血凝測(cè)定（TPHA）和酶免疫測(cè)定（EIA）。FTA-ABS和TPHA是以梅毒螺旋體Nichols株為抗原，具有靈敏度和特異性高的特點(diǎn)，常用于梅毒篩查陽性結(jié)果的確認(rèn)。而梅毒螺旋體的完整基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)主要的蛋白質(zhì)抗原（Tp15、Tp17、Tp45、Tp47）具有強(qiáng)免疫原性，并被認(rèn)為是梅毒血清學(xué)診斷的重要靶點(diǎn)。基于最新的酶聯(lián)免疫（EIA）或化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）同時(shí)檢測(cè)IgM和IgG抗體，與單獨(dú)檢測(cè)IgG相比，可提高靈敏度和特異性，從而縮短檢測(cè)窗口期［11］。

2.2.1 梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）TP-ELISA法最早采用全血溶解產(chǎn)物作為抗原包被在微孔板上，加入待檢血清和酶標(biāo)抗體，檢測(cè)獻(xiàn)血者血漿中抗TP特異性抗體，后來使用重組抗原代替野生抗原的ELISA試劑盒，有效提高了檢測(cè)靈敏度，梅毒檢測(cè)的主要膜蛋白主要包括Tp15、Tp17、Tp45和 Tp47 等［12］。Van voorhis 等［13］發(fā) 現(xiàn) 重 組 Tp92、Tp0257、Tp0453均具有很強(qiáng)的免疫原性，均可分別應(yīng)用于ELISA檢測(cè)的評(píng)估，與傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果吻合，可成為Tp抗體的備選抗原。Smith等［14］篩選Tp0453和Tp0326組成的嵌合物作為包被抗原建立ELISA法，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用Tp0453和Tp0326重組蛋白可提高靈敏度和特異性。曾鐵兵等［15］、伍寧等［16］分別采用rTp0971、rTp0821蛋白包被微孔，建立間接ELISA法用于檢測(cè)臨床血清樣本，結(jié)果rTp0971-ELISA特異性為100%，敏感性為89.1%；與rTp0821-ELISA的結(jié)果符合率達(dá)95.6%，表明二種蛋白具有良好的抗原性，可應(yīng)用于TP抗體檢測(cè)。此外，Long等［17］通過研究發(fā)現(xiàn)，重組Tp0965抗原在梅毒發(fā)病的各臨床階段的靈敏度都比較高。然而研究表明梅毒患者治愈后，體內(nèi)特異性抗體TP-IgG在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)仍可存在，甚至終身維持。因此，TP-ELISA陽性只能說明曾經(jīng)感染過或正在感染梅毒，很多TP-ELISA陽性的獻(xiàn)血者可能為梅毒治愈者，但是卻仍然被屏蔽不能獻(xiàn)血和所獻(xiàn)血液報(bào)廢，對(duì)保護(hù)獻(xiàn)血者權(quán)益和保留固定獻(xiàn)血者產(chǎn)生不利影響。

2.2.2 蛋白免疫印跡法（Western blot，WB） 梅毒螺旋體檢測(cè)的蛋白印跡與HIV抗體確認(rèn)的蛋白印跡試驗(yàn)方法類似，都提供了特征性分子條帶。如檢測(cè)到分子量為15.5kDa、17kDa、45kDa和47kDa的三種以上主要抗原即可確認(rèn)Tp陽性結(jié)果。WB既可以檢測(cè)IgG也可以檢測(cè)IgM抗體，是一項(xiàng)用于梅毒檢測(cè)的確證試驗(yàn)［18］。然而該法人工操作步驟復(fù)雜，難以適應(yīng)采供血機(jī)構(gòu)需要的快速全自動(dòng)檢測(cè)，多在科研機(jī)構(gòu)病原實(shí)驗(yàn)室使用，很少在采供血的血液篩實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

2.2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA） CLIA是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶等的檢測(cè)分析技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏度高、線性范圍寬、試劑穩(wěn)定、無污染和衰變、檢測(cè)耗時(shí)短和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）》提出化學(xué)發(fā)光免疫分析試驗(yàn)可用于獻(xiàn)血者的血清學(xué)檢測(cè)［19］。Tao等［20］應(yīng)用羅氏公司Elecsys電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、雅培公司Laboratories Architect化學(xué)發(fā)光微粒免疫測(cè)定法以及中國常用的InTec和KHB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)比較了13 767份血清樣本，并用免疫印跡法確認(rèn)陽性測(cè)試結(jié)果。羅氏Elecsys免疫測(cè)定的靈敏度為100%，雅培 Architect為98.26%，InTec為99.11%，KHB為98.56%。羅氏Elecsys免疫測(cè)定法的特異性為99.81%，雅培Architect為99.74%，InTec與KHB分別為99.93%與99.80%。對(duì)于臨界值樣本，與其他測(cè)試相比，Elecsys免疫測(cè)定法無假陰性結(jié)果，假陽性結(jié)果更少。

2.2.4 膠體金免疫層析法（colloidal gold immunechromatography，GICA） GICA應(yīng)用純化重組梅毒抗原，用膠體金標(biāo)記，使其在硝酸纖維素膜上反應(yīng)，以雙抗原夾心法快速檢測(cè)血清梅毒螺旋體特異性抗體。徐長根等［21］應(yīng)用GICA篩查60 402名獻(xiàn)血者，并與TP-ELISA相比較，陰性合格率為99.7%，陽性符合率為72.0%；TP-GICA陰性符合率為99.8%，陽性符合率為67.0%。

2.2.5 梅毒PCR檢測(cè)技術(shù) PCR作為重要的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于病原體檢測(cè)。目前PCR擴(kuò)增梅毒螺旋體的DNA片段主要是針對(duì)編碼Tp0574（tpp47）、Tp1016（bmp）、Tp0105（polA）、Tp0117（tprC）、Tp0319（tmpC）、Tp0136、Tp0548 等梅毒螺旋體特異性抗原的TpDNA的開放編碼區(qū)。在感染早期血清學(xué)檢測(cè)無反應(yīng)時(shí)PCR即可識(shí)別梅毒螺旋體，顯著縮短檢測(cè)窗口期，更為重要的是PCR可以區(qū)分梅毒螺旋體感染和其他螺旋體感染，降低假陽性率［22］。目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于梅毒檢測(cè)的PCR方法有常規(guī)PCR、巢式PCR（Nested PCR）、熒光定量PCR（realtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR）、多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）等。熒光定量PCR應(yīng)用比較廣泛，其原理是在PCR體系中加入一段與目的擴(kuò)增序列互補(bǔ)，二十幾個(gè)堿基的熒光探針——寡核苷酸。伴隨PCR目的基因擴(kuò)增，Taq酶5'端至3'端外切酶活性使探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，最終檢測(cè)到報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光。PCR反應(yīng)中每擴(kuò)增出一條產(chǎn)物就會(huì)有一個(gè)熒光分子形成，熒光的累積和PCR產(chǎn)物的形成同步。因此，通過檢測(cè)PCR熒光值的變化即可準(zhǔn)確反映擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)?；赑CR檢測(cè)的優(yōu)越性，2014年歐洲梅毒管理規(guī)范提出實(shí)驗(yàn)室要廣泛應(yīng)用PCR檢測(cè)［23］。目前，我國采供血系統(tǒng)僅將PCR技術(shù)應(yīng)用于HIV、HBV及HCV的檢測(cè)，TP尚未列入核酸檢測(cè)項(xiàng)目。隨著研究發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性更高的TP靶基因，PCR技術(shù)將大規(guī)模應(yīng)用于獻(xiàn)血者血液檢測(cè)。

3 結(jié) 語

綜上所述，雖然我國采供血機(jī)構(gòu)輸血傳播梅毒相關(guān)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用方法有很多種，但是仍然缺乏可以檢測(cè)梅毒各個(gè)臨床階段的金標(biāo)準(zhǔn)方法。梅毒患者治愈后，體內(nèi)特異性抗體TP-IgG抗體相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)仍可存在，甚至終身維持，因此，TP-ELISA反應(yīng)性并不代表獻(xiàn)血者正在感染梅毒。美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2013年頒布了針對(duì)抗-TP篩查反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊(duì)指南，中國輸血協(xié)會(huì)血液質(zhì)量管理工作委員會(huì)于2015年發(fā)布了反應(yīng)性獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南，既往感染梅毒經(jīng)治愈一定時(shí)間的獻(xiàn)血者，經(jīng)過評(píng)估后將可再次獻(xiàn)血。隨著重組抗原TPELISA、WB、化學(xué)光免疫測(cè)定技術(shù)及熒光定量PCR等新技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)進(jìn)一步提高獻(xiàn)血者梅毒檢測(cè)的靈敏度和特異性，防控輸血傳播梅毒，確保血液安全具有重大意義。