同工酶檢測方法及其研究進(jìn)展

楊光瑞，洪 霞，何海寧，安小蘋，安 娜，袁順捷，金 瑩，楊菊梅

(1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州 730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測有限公司，甘肅蘭州 730010；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州 730000)

同工酶是在長期的生物進(jìn)化中，生物體為適應(yīng)環(huán)境而形成的由不同基因或等位基因編碼的一類能夠催化相同化學(xué)反應(yīng)、結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)[1]。自1959年Marker等[2]提出同工酶概念以來，同工酶分析技術(shù)發(fā)展已接近60年了。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)并研究的同工酶多達(dá)幾百種，經(jīng)常運(yùn)用的同工酶有肌酸激酶同工酶、過氧化物同工酶、酯酶同工酶、超氧化物氣化歧化酶、脫氫酶同工酶、過氧化氫酶同工酶等[3-5]。隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，同工酶分析技術(shù)在動物、植物、微生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等方面都取得了十分顯著的成果，如利用肌酸激酶同工酶作為生物標(biāo)記物進(jìn)行疾病的臨床診斷、過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶物種遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒別等[3-6]。此外，同工酶檢測技術(shù)為分析生物繁殖、體細(xì)胞雜交、染色體倍性、基因分化和表達(dá)、生物多樣性保護(hù)等提供了一個(gè)新的途徑[7-9]，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。筆者對近年來同工酶檢測技術(shù)的發(fā)展和同工酶在動植物種質(zhì)資源鑒定、疾病的臨床診斷等主要應(yīng)用領(lǐng)域的現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，并對同工酶檢測今后的發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為同工酶檢測在更多領(lǐng)域中的應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 同工酶的檢測方法

1.1瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行同工酶的分析，主要是利用瓊脂糖的分子篩作用，在電場力的作用下將分子量大小不同的同工酶分子進(jìn)行分離[10]。該方法與聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)相比，凝膠制備過程簡單，電泳時(shí)間短，能夠篩選出不同活性的酶，但其不論是分辨率還是分離效果均不如PAGE凝膠[11]。黃孝湘等[12]利用瓊脂糖凝膠電泳方法分析了孝感市池塘靜水和橋下流水中生活的克氏原螯蝦主要組織的LDH 同工酶譜，結(jié)果表明，克氏原鰲蝦不同組織中LDH同工酶譜存在差異；進(jìn)一步根據(jù)同工酶條帶染色深淺，判斷出流水中克氏原螯蝦組織的LDH同工酶活性強(qiáng)于靜水。

1.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)檢測Native-PAGE電泳也叫活性電泳，該電泳體系中不添加十二烷基磺酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇，將有活性的同工酶蛋白直接進(jìn)行電泳[13]。利用凝膠的分子篩效應(yīng)和蛋白的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，在電泳過程中并不破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象及其亞基間的相互作用。因此，在電泳結(jié)束后，蛋白仍能保持其活性[13-14]。在電泳結(jié)束后，將凝膠塊在適宜的條件下與特異性底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，便可在凝膠中觀察到同工酶特異性條帶。該方法是目前同工酶分離提純和檢測的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)在于分離到有活性同工酶蛋白仍具有活性，得到的同工酶譜帶具有很強(qiáng)的專一性，結(jié)果易于觀察[15]。但由于同工酶在凝膠中的遷移率與其分子量和所帶電荷呈正相關(guān)，在電泳過程中很可能由分子量所導(dǎo)致的遷移率被電荷導(dǎo)致的遷移率所補(bǔ)償，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，Native-PAGE電泳過程必須在低溫下進(jìn)行，以確保酶活性。尹明華等[16]運(yùn)用該方法對江西鉛山紅芽芋低溫療法脫毒苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)同工酶譜進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在脫毒苗中得到的同工酶譜帶與大田苗譜帶一致，證明了紅芽芋低溫療法脫毒苗具有很高的遺傳穩(wěn)定性，無遺傳變異。

1.3變性-復(fù)性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測SDS-PAGE電泳的變性過程是利用SDS與同工酶多肽分子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的[15]。SDS分子攜帶大量的負(fù)電荷，當(dāng)其結(jié)合在同工酶多肽分子中時(shí)，掩蔽了同工酶分子本身所攜帶的電荷，消除了電荷對同工酶電泳遷移率的影響[12]，再利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩作用，將分子質(zhì)量有差異的同工酶分離。但由于SDS是一種可逆的變性劑，由它所導(dǎo)致的變性，在電泳完畢后加入TritonX-100除去SDS，變性的同工酶便可重新恢復(fù)活性，再與相應(yīng)的底物進(jìn)行染色反應(yīng)，便可達(dá)到檢測目的[15]。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于SDS的引入消除了同工酶本身所攜帶的電荷對電泳遷移率的影響，電泳過程無需在低溫下進(jìn)行。缺點(diǎn)在于在電泳完畢后要對蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性，操作比較繁瑣。該方法仍是目前同工酶檢測最常用的方法之一[12，15]。廖海等[17]利用該方法對5種菖蒲屬植物中過氧化物酶(POD)同工酶進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用該方法得到了含有6條POD同工酶帶，而傳統(tǒng)的分析方法只得到了5條POD同工酶帶。

1.4雙向凝膠電泳檢測雙向凝膠電泳是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對分子量的差異進(jìn)行分離，具體的操作方法是將同工酶樣品根據(jù)等電點(diǎn)大小進(jìn)行第1向分離；再將已完成第1向分離的酶分子以垂直于第1向的方向按照分子量大小進(jìn)行第2向電泳，得到雙向分離的同工酶圖譜[13]。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于其分辨率和分離效果優(yōu)于其他任何單向電泳，缺點(diǎn)在于所分離同工酶常常容易失活，尤其不適用于堿性同工酶的分析[18-19]。張少麗等[19]利用雙向凝膠電泳對大白菜溫敏雄性不育系TsCMS7311(A)及其保持系7311(B)的小花蕾的β-酯酶同工酶帶區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保持系B和轉(zhuǎn)化后的不育系A(chǔ)T在經(jīng)過第1向電泳后均具有2條特異性β-酯酶同工酶譜帶，而在經(jīng)過第2向電泳后各得到了6個(gè)β-酯酶同工酶特異性條帶。

2 同工酶分析技術(shù)的應(yīng)用

2.1同工酶在植物水平遺傳多樣性分析中的應(yīng)用同工酶作為基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，其差異性反映了基因表達(dá)的差異性，因此對生物體同工酶譜的分析可間接獲得基因?qū)用娴牟町怺7，9]。同工酶除了具有物種和組織特異性外還具有高度保守性，同一物種的相同組織中同工酶譜具有很高的相似度，是研究種間和種內(nèi)遺傳多樣性的重要手段[20-21]。過氧化物酶(POD)同工酶廣泛存在于植物組織中，具有很強(qiáng)的氧化還原活性，參與植物體內(nèi)許多催化反應(yīng)。在不同植物和同一植物不同的生長階段POD同工酶的活性和數(shù)目差異很大，因此它能夠很大程度上反映植物生長、代謝特點(diǎn)、品種之間的遺傳差異。同時(shí)，POD同工酶圖譜在一定條件下較為穩(wěn)定，具有種屬特異性，是一種良好遺傳標(biāo)記物，目前已被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析[22-24]。馬永平等[25]對寧夏枸杞和黑果枸杞中過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)及超氧化物歧化酶(SOD)同工酶酶譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這2種枸杞中，EST和SOD同工酶酶譜所包含的遺傳信息有限，而POD同工酶酶譜所攜帶的遺傳信息豐富且差異顯著，因而POD可作為枸杞同工酶遺傳多樣性分子標(biāo)記。李淑娟等[26]對三江源自然保護(hù)區(qū)的6個(gè)野生種10個(gè)居群的鵝觀草屬進(jìn)行POD同工酶譜帶特征分析，結(jié)果表明，三江源地區(qū)鵝觀草屬植物遺傳多樣性豐富，不同種間POD 同工酶酶譜特征及相似程度上均有一定差異，同一物種的不同居群間酶譜既具有較穩(wěn)定的相似性，又具有細(xì)微差異。

除POD外，目前已有多種同工酶已作為分子標(biāo)記用于評價(jià)植物遺傳變異性、親緣關(guān)系和種系發(fā)生等方面，并取得了很好的效果[21]。肖慧等[27]對文山三七等5種三七的POD、EST和乳酸脫氫酶(LDH)等6種同工酶譜進(jìn)行分析，根據(jù)同工酶酶譜所得的遺傳距離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃果三七、紫果三七和廣西三七的遺傳關(guān)系較近，而文山與廣西三七的遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

同工酶氨基酸序列受基因控制，而表達(dá)結(jié)果受遺傳和環(huán)境的雙重影響，其氨基酸分子改變，導(dǎo)致蛋白組結(jié)構(gòu)、帶電荷量、電泳遷移率改變，因而使其在揭示群體之間和群體內(nèi)的遺傳變異、親緣關(guān)系等方面具有顯著的優(yōu)勢。此外還可通過共顯性同工酶數(shù)據(jù)中每個(gè)位點(diǎn)的等位基因的有效數(shù)量、雜合性和多態(tài)性對植物遺傳變異進(jìn)行評估。El-Esawi等[28]利用酸性磷酸酶(ACP)、過氧化氫酶(CAT)及EST同工酶酶譜研究了萵苣的遺傳變異、種群結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，結(jié)果表明，同工酶系統(tǒng)共顯示16個(gè)位點(diǎn)，共31個(gè)等位基因；在這16個(gè)位點(diǎn)中，11個(gè)多態(tài)性；種間遺傳分化(F-ST)表明，種間同工酶變異占51.3%，種間遺傳變異占48.7%；總雜合度(H-T)和附加內(nèi)遺傳多樣性(H-S)的平均值分別為0.352和0.171；間遺傳多樣性(D-ST)為0～0.424，平均為0.180；該結(jié)果證明了萵苣多起源的假說。因此，這種高度的遺傳變異證明同工酶對萵苣的多態(tài)性分析是有效的。Ahmed等[29]采用同工酶分析技術(shù)，對沙特阿拉伯的7種茄屬植物的遺傳變異及親緣關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄屬植物多態(tài)位點(diǎn)的比例從黑穗病菌的0.87位點(diǎn)到白穗病菌的0.80位點(diǎn)，平均雜合度在0～1.00，平均期望雜合度在0～0.50；該結(jié)果證實(shí)了所研究的茄屬植物具有廣泛的遺傳多樣性。

2.2同工酶在疾病診斷和監(jiān)測中的應(yīng)用同工酶具有器官特異性，特定的同工酶只在特定的器官組織發(fā)揮作用，當(dāng)其發(fā)生變化時(shí)，則預(yù)示著組織病變或其他不正常的變化[30-31]。通過對這些同工酶的檢測，可迅速定位病變組織和疾病的類型，為臨床疾病的診斷提供了重要依據(jù)[29-32]。肌酸激酶(CK)及其同工酶CK-MB是目前國內(nèi)外常用于臨床診斷心肌是否發(fā)生病變的重要酶學(xué)檢測指標(biāo)[33]。此外，對丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同工酶等同工酶的研究結(jié)果也預(yù)示著同工酶在未來可能作為重要的疾病診斷的檢測指標(biāo)[34]。Lu等[35]研究了丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)的表達(dá)對肝癌的臨床特征及預(yù)后的影響，結(jié)果表明，PKM2高表達(dá)組(≥11.25%)與PKM2低表達(dá)組(<11.25%)相比，肌酐水平顯著降低(P=0.043)，胎蛋白水平顯著升高(P<0.001)；同時(shí)，PKM2表達(dá)高的患者與PKM2表達(dá)低的患者相比預(yù)后差；該研究為今后研究肝癌的發(fā)病機(jī)制和藥物發(fā)現(xiàn)提供了有價(jià)值的信息。林娜等[36]對血清乳酸脫氫酶(LDH)及其同工酶M、H亞單位值在復(fù)治多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，對于復(fù)治復(fù)發(fā)性骨髓瘤患者，血清LDH同工酶與ISS分期及腎功損害的程度密切相關(guān)，LDH同工酶測定比總LDH活性更具有臨床價(jià)值。乳酸脫氫酶主要催化乳酸和丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)換，在癌細(xì)胞有氧糖酵解代謝途徑中扮演關(guān)鍵角色。LDH同工酶家族成員的特征、基因表達(dá)及其在腫瘤診斷中具有十分重要的意義[37]。許多研究者也致力于同工酶在禽類疾病檢測方面的應(yīng)用，并取得了顯著的成果。李楊等[38]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳檢測技術(shù)，對乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)等同工酶酶譜進(jìn)行了分析，并結(jié)合3株柔嫩艾美耳球蟲的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)敏感株與耐藥株之間的3種同工酶酶譜存在差異，敏感株間無差異，耐藥株間有差異，同時(shí)各酶的結(jié)果也不一致。說明在建立參考株與單一藥物耐藥株同工酶酶譜的情況下，可以用同工酶檢測法對球蟲進(jìn)行耐藥性檢測。

2.3同工酶在種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用同工酶中氨基酸的排列順序決定了同工酶的種類，而氨基酸的排列順序是由編碼該蛋白的基因決定的，因此蛋白變化能反映DNA分子水平上的變化，同工酶分析是蛋白質(zhì)分子水平上研究物種遺傳分化、分析鑒定的有效手段。王晗等[6]對黑龍江省主栽的2個(gè)黑木耳品種采集的10個(gè)不同地區(qū)引種的栽培菌株進(jìn)行了EST同工酶酶譜多樣性比較研究，結(jié)果表明，10個(gè)菌株EST同工酶酶譜共有8條譜帶，相似酶帶較多，相似系數(shù)在0.81～1.00；在相似水平為0.81時(shí)，可將10個(gè)菌株分為3個(gè)組群，第1組群包括8個(gè)菌株，第2、第3組群各1個(gè)菌株，同一品種不同來源引種的菌株酶譜差異顯著，而不同品種的酶譜卻無差異，表明用種市場菌種名稱較為混亂。郭海林等[39]對結(jié)縷草屬14個(gè)雜交組合的親本與后代的POD與EST同工酶酶譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明，結(jié)縷草的雜交后代在酶帶數(shù)目以及酶帶活性強(qiáng)弱方面與雙親存在較大的差異，而且還出現(xiàn)了數(shù)量不等的雙親所沒有的“特征酶帶”；在所鑒定的44個(gè)后代中，有25個(gè)后代具有父本的特征帶，2個(gè)后代具有其他任何材料均沒有的一條特征帶，這27個(gè)后代可以初步鑒定為真雜種。陶芳等[40]分析了雜交水稻不同發(fā)育時(shí)期材料、不同取材部位EST的表達(dá)，結(jié)果表明，3～4 d芽齡的幼苗為最適宜的鑒定時(shí)期，取材部位不影響標(biāo)記酶帶的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)型在種子真實(shí)性和純度鑒定中具有一定利用價(jià)值。尹明華等[16]利用分析紅芽芋低溫療法脫毒苗SOD、POD 和CAT 同工酶酶譜的方式對其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，該研究為脫毒苗的遺傳穩(wěn)定性檢測提供一些同工酶方面的依據(jù)。

3 同工酶檢測的發(fā)展前景

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，同工酶分析技術(shù)愈加成熟，應(yīng)用更加廣泛，目前該技術(shù)已在動植物、微生物、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前，同工酶的檢測技術(shù)在植物分類研究、種質(zhì)鑒定和疾病檢測方面應(yīng)用較為廣泛。由于植物在差異較大的環(huán)境中生長時(shí)其形態(tài)特征變化很大，因而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法受到了很大的限制，分子生物學(xué)的方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高，但其費(fèi)用較高，試驗(yàn)操作較為復(fù)雜，限制了其應(yīng)用。而同工酶檢測技術(shù)利用檢測基因表達(dá)的直接產(chǎn)物的變化，間接反映DNA分子中的變化，其具有組織特異性和物種特異性的特點(diǎn)，且該方法費(fèi)用低、操作簡單、結(jié)果易于分析，在物種分類和遺傳鑒定方面具有十分可觀的應(yīng)用前景。

從商業(yè)化的角度出發(fā)，作為蟹中之冠的陽澄湖大閘蟹近年來紅遍大江南北，據(jù)報(bào)道，目前市場上出售的陽澄湖大閘蟹基本都是冒充貨，但到目前為止，沒有有效的檢測方法，給市場監(jiān)管帶來了很大的困難，也給消費(fèi)者帶來了巨大的損失。同工酶在不同生長環(huán)境下具有顯著的表達(dá)差異，因此可通過同工酶檢測技術(shù)，對陽澄湖大閘蟹進(jìn)行鑒定，規(guī)范市場秩序，保障消費(fèi)者的利益。此外，近年來，中藥材資源的短缺，市場價(jià)格飆升，導(dǎo)致大量的不法商販以次充好，用品質(zhì)差的藥材冒充道地藥材，謀取利益。同工酶在種質(zhì)鑒定中的優(yōu)勢，可用于中藥材資源的鑒定。

在醫(yī)學(xué)研究和疾病診斷方面，一般當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)患病時(shí)已經(jīng)是中晚期，錯(cuò)過了最佳的治療階段，給臨床治療帶來了很多麻煩，同時(shí)也給患者帶來了更多的痛苦。隨著研究的深入，越來越多的同工酶與組織病變的關(guān)系更加清晰，診斷將更及時(shí)、更準(zhǔn)確，切實(shí)地幫助患者早診斷、早治療、早治愈。綜上所述，同工酶在諸多領(lǐng)域都具有潛在的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。