游離腫瘤細(xì)胞術(shù)后滅活的研究進(jìn)展

吳軍，胡龍霞，劉文斌

1武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，武漢430023

2解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院護(hù)理部，西安710032

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢4300220

胸腹腔腫瘤切除手術(shù)常有腫瘤細(xì)胞脫落并發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，其中以胃癌、肝癌、肺癌、食管癌較多見(jiàn)[1-4]。腫瘤細(xì)胞脫落與腫瘤患者的漿膜受累程度、TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及術(shù)后轉(zhuǎn)移類型等有關(guān)[4-7]。同時(shí)，手術(shù)也可以增加腫瘤細(xì)胞脫落或激活休眠的腫瘤細(xì)胞，這類因手術(shù)脫落游離且有生物活性的腫瘤細(xì)胞即為游離腫瘤細(xì)胞（free-tumor cell，F(xiàn)TC），由FTC形成的亞臨床轉(zhuǎn)移灶是腫瘤術(shù)后播散、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要原因[5]，也是腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素[8-9]。無(wú)瘤技術(shù)是指在惡性腫瘤切除手術(shù)過(guò)程中為了防止或減少腫瘤細(xì)胞的脫落、種植和播散而采取的一系列措施，其主要目的是在手術(shù)始末滅活、清除FTC，對(duì)預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)具有重要意義，而其中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是胸腹腔沖洗[10]。然而，胸腹腔沖洗時(shí)，沖洗液體的選擇在諸多研究中各有不同，并且沖洗的條件也有差異。腫瘤復(fù)發(fā)的模式中有腫瘤細(xì)胞的胸膜/腹膜播散、術(shù)中脫落種植，而胸腹腔沖洗則可以降低脫落腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性率，從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。1989年，Paget提出的“種子-土壤”學(xué)說(shuō)提到，胸腹腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞經(jīng)多種途徑脫落，形成“種子”，手術(shù)及創(chuàng)傷性操作等機(jī)械性損傷使腹膜間皮組織裸露形成所謂的“土壤”，兩者相互作用與其他細(xì)胞、化學(xué)因子等共同促使FTC轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)。

1 無(wú)瘤技術(shù)滅瘤原理

1.1 蒸餾水和生理鹽水滅瘤原理

蒸餾水屬于不含有形成分和雜質(zhì)并且滲透壓接近于零的低滲液體，人體組織細(xì)胞的滲透壓為280～310 mOsm/L，因而蒸餾水可以使腫瘤細(xì)胞腫脹、裂解，進(jìn)而滅活腫瘤細(xì)胞。由于蒸餾水是低滲液體，其在使腫瘤細(xì)胞腫脹的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，從而影響吻合口愈合；另外，氯離子通道會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)或阻斷而增強(qiáng)細(xì)胞毒作用及加劇低滲性休克。相關(guān)研究表明，術(shù)后蒸餾水沖洗浸泡后，胃癌患者有血壓降低、房性早搏等不良反應(yīng)發(fā)生[11-12]。目前，多數(shù)研究支持生理鹽水替代蒸餾水作為腫瘤手術(shù)的常規(guī)沖洗液[13-14]。

1.2 聚維酮碘溶液和乙醇滅瘤原理

表面活化劑聚維酮碘起著載體和協(xié)助溶解的作用，在膠粒束中央可以運(yùn)載不定型的絡(luò)合物，隨著聚維酮碘被稀釋而逐漸釋放游離碘。游離碘結(jié)合有機(jī)物后能夠迅速地表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞蛋白產(chǎn)生不可逆性交聯(lián)作用并殺死原核細(xì)胞，對(duì)多種細(xì)菌、病毒等均有殺滅作用。游離碘被消耗后，絡(luò)合狀態(tài)的聚維酮碘又可以釋放游離碘，直到可利用的碘被消耗完全。乙醇是蛋白質(zhì)活性的強(qiáng)烈抑制劑，不僅能夠直接固定和破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶等，而且還可以使腫瘤細(xì)胞迅速脫水，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變性而被滅活[15-16]。但是，交聯(lián)的蛋白會(huì)形成保護(hù)層，當(dāng)滅活腫瘤細(xì)胞粘黏或重疊時(shí)，將會(huì)影響乙醇滲透到深層細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)層細(xì)胞的滅活效果欠佳。因而，有研究采用肝素?zé)o水乙醇沖洗腹腔，以減少FTC的粘黏[17]。

2 FTC檢測(cè)方式

2.1 腹膜細(xì)胞學(xué)

腹膜細(xì)胞學(xué)（peritoneal lavage cytology，PLC）屬于病理細(xì)胞學(xué)（cytopathology，CP）的一種，是檢測(cè)FTC存在的金標(biāo)準(zhǔn)[5,18]，其診斷依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。PLC不僅可以甄別腫瘤細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)，而且還可以用來(lái)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞滅活后計(jì)數(shù)，對(duì)甄別微量腫瘤細(xì)胞的特異度較好但靈敏度欠佳[19]。PLC的陽(yáng)性率較低、漏診率高，尤其當(dāng)腫瘤細(xì)胞較少并散布在炎性細(xì)胞和間皮細(xì)胞間時(shí)，依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)作出診斷的難度則大大增加；而且，在沖洗過(guò)程中腫瘤細(xì)胞往往有較明顯的退變現(xiàn)象，更增加了診斷的難度[20-21]。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）可以定性或定量分析細(xì)胞，檢測(cè)FTC的靈敏度高、速度快、可靠性好。結(jié)合分子的特異性和分子生物學(xué)方法，常用消化道腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白 20（cytokeratin 20，CK20）及上皮細(xì)胞膜抗原（epithelial cell membrane antigen，EMA）檢測(cè)腹腔腫瘤術(shù)后的FTC[22-23]。

2.3 免疫組織化學(xué)法

免疫組織化學(xué)法（immunocytochemistry，ICC）檢測(cè)時(shí)干擾因素較少，檢出率高，操作簡(jiǎn)單快捷，結(jié)合PLC的效果更為明顯，尤其在胃癌術(shù)后FTC的檢測(cè)中應(yīng)用較多。腹腔沖洗液中FTC經(jīng)過(guò)富集后，通過(guò)ICC檢測(cè)EMA、CEA、CK20等大分子，可以證明FTC存在及計(jì)算FTC的數(shù)量[5-6]。

2.4 其他檢測(cè)技術(shù)

在微量腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)中，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)顯示出很好的特異度（48.5%）和靈敏度（55.8%），RT-PCR主要用于篩查信使RNA（messenger RNA，mRNA）[19]，對(duì)mRNA采集和檢測(cè)的要求很高，操作復(fù)雜，需要嚴(yán)格對(duì)照，費(fèi)用昂貴[6]；而針對(duì)細(xì)胞活性測(cè)定的磁激活細(xì)胞分離術(shù)（magneticactivated cell separation，MACS）[24]、臺(tái)盼藍(lán)染色法和噻唑藍(lán)法也是FTC檢測(cè)的常用方法[25]。

3 體腔沖洗條件

3.1 沖洗液的溫度

熱療能使腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)蛋白變性，改變細(xì)胞膜的通透性。相關(guān)研究表明，24～26℃的沖洗液會(huì)增加患者心腦血管意外、術(shù)后腹腔內(nèi)感染和切口感染的風(fēng)險(xiǎn)，失血量也可能增加，并且還會(huì)對(duì)機(jī)體的凝血功能和免疫功能造成不同程度的抑制[9,26]。30℃沖洗液沖洗前后患者的生命體征有明顯變化[8,27]；常溫沖洗可以有效減少腫瘤切除術(shù)后腹腔壁FTC的粘黏。35～40℃接近患者的體腔溫度[28]，36～38℃常為體溫維持溫度，沖洗過(guò)程中患者的生命體征平穩(wěn)無(wú)波動(dòng)，40～43℃雙蒸餾水可以使腫瘤細(xì)胞呈破碎樣改變，而且對(duì)正常組織不會(huì)造成明顯傷害[28]，超過(guò)45℃時(shí)正常組織便會(huì)受到不可逆損傷。41℃生理鹽水沖洗可以明顯減少患者術(shù)后低體溫（手術(shù)中體溫≤36℃）、寒顫的發(fā)生，而且利于血乳酸的清除，降低患者的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），減輕應(yīng)激反應(yīng)。相關(guān)研究表明，42.5℃/43℃沖洗液沖洗時(shí)腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)不可逆損傷[29-30]，但目前尚無(wú)研究闡明0.5℃的溫度差。43～45℃沖洗液沖洗時(shí)除了可以增加細(xì)胞的通透性外，還可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[31]。腹腔熱灌注化療（chemotherapeutic hyperthermic intraperitoneal perfusion，CHIP）中采取 47～50℃沖洗液，當(dāng)沖洗液溫度為50～55℃時(shí)，F(xiàn)TC會(huì)很快死亡[30,32]，該溫度對(duì)正常細(xì)胞的損傷也很大。但在動(dòng)物研究中，40～44℃條件下沖洗則可以選擇性地殺滅FTC[33]，這在使用蒸餾水和生理鹽水作為沖洗液時(shí)尤為典型，但是肺癌術(shù)中進(jìn)行切口及胸腔滅瘤沖洗時(shí)首選43℃的聚維酮碘稀釋液[34-35]。

3.2 沖洗液的濃度

75%～95%乙醇滅菌效果優(yōu)于生理鹽水，乙醇濃度（＜95%）越高，對(duì)骨腫瘤細(xì)胞的滅活效果就越明顯，但是40%乙醇對(duì)食管腫瘤細(xì)胞的抑制作用較75%乙醇更為明顯[36-37]。有效碘稀釋度為0.01%～0.50%，隨著稀釋倍數(shù)的增加，游離碘濃度不斷升高，抗菌滅瘤活性也不斷增強(qiáng)，提示聚維酮碘滅瘤作用的強(qiáng)弱與聚維酮碘的濃度有關(guān)，而0.25%～1%聚維酮碘溶液有同等滅菌效應(yīng)[38]。0.5%的聚維酮碘溶液為臨床常規(guī)用藥，不僅可以達(dá)到滅菌效果[39]，還可以促進(jìn)局部傷口愈合，并且不用配制，可直接使用并且取材快速、方便、成本低。1%～2%聚維酮碘溶液能夠滅活多種腫瘤細(xì)胞，但是對(duì)正常細(xì)胞也有一定的細(xì)胞毒性。43℃下0.05%聚維酮碘的抑瘤率最高，但也有研究表明1%的聚維酮碘溶液是在安全范圍內(nèi)具有最強(qiáng)殺傷效果的濃度[40]。5%聚維酮碘在小鼠實(shí)驗(yàn)中被證明滅活結(jié)腸癌FTC的效果明顯[41-42]，10%聚維酮碘溫?zé)嵝厍粵_洗和輔助化療可以降低胸膜間質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率[43]。

3.3 沖洗次數(shù)和灌洗液體積

體外研究表明，蒸餾水沖洗2～3次滅活FTC的效果比沖洗1次要明顯，沖洗次數(shù)大于4次，F(xiàn)TC滅活效果與沖洗3次無(wú)差異[21,44]。但是腫瘤切除術(shù)后無(wú)水乙醇沖洗1次的滅瘤效果就已相當(dāng)于蒸餾水沖洗3次。腫瘤切除手術(shù)中，為了減少或滅活FTC，術(shù)者常用1.0～4.5 L沖洗液沖洗腹腔，綜合相關(guān)研究提示，平均會(huì)用去（2000±500）ml沖洗液[36,45]。

3.4 沖洗的時(shí)間

蒸餾水浸泡5 min即可殺滅器械上的FTC，沖洗14 min后可以引起腫瘤細(xì)胞裂解，沖洗32 min后基本可以殺死腹腔脫落的腫瘤細(xì)胞。0.01%聚維酮碘作用于結(jié)腸腫瘤細(xì)胞1 min即可出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制作用并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，器械浸泡于40℃的0.5%聚維酮碘溶液10 min的滅瘤率能達(dá)到90%以上，但在體內(nèi)的研究表明，該條件下熱化療不能達(dá)到上述效果[41]。亦有蒸餾水或生理鹽水沖洗15、30、45、60 min的研究，在研究無(wú)水乙醇滅活FTC時(shí)間區(qū)間5～60 s時(shí)，10 s FTC滅活率即可達(dá)到95%，15 s后趨向穩(wěn)定且皆大于99%[23,39]。

3.5 其他條件

微波滅瘤原理類似于高溫滅菌，常用溫度為40～60℃，時(shí)間為10～30 min，該類研究以體內(nèi)研究為主[46]。滅活腫瘤細(xì)胞時(shí)，在43℃30 min條件下，F(xiàn)TC的滅活率僅為18%，相同時(shí)間內(nèi)溫度提升1℃，F(xiàn)TC的滅活率可達(dá)到85%。光波分為不可見(jiàn)光和可見(jiàn)光，不可見(jiàn)光有紅外線與紫外線，紅外線滅瘤原理為加熱，紫外線滅瘤原理為直接破壞DNA，兩者的滅瘤效應(yīng)與強(qiáng)度和時(shí)間成正比；可見(jiàn)光主要激發(fā)核黃素產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)從而滅活FTC。磁場(chǎng)效應(yīng)主要是利用Fe3+（Fe3O4）納米粒子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)，如電泳作用，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的負(fù)電荷離子的移動(dòng)速度和排列形式產(chǎn)生影響，使細(xì)胞表面蛋白分子帶電荷能力和分布改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)行為改變[25,47]。

相關(guān)研究認(rèn)為，單純沖洗難以充分滅活FTC，故額外加入5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑、四環(huán)素、慶大霉素等化療藥物或抗菌藥物進(jìn)行持續(xù)腹腔沖洗/CHIP以增強(qiáng)滅瘤效應(yīng)[25,48]，這是胃腸癌術(shù)后預(yù)防腹腔種植和肝轉(zhuǎn)移較重要的手段。甚至有研究將氯己定混入沖洗液以增強(qiáng)FTC的滅活效果，亦有單獨(dú)探討Cl-1滅瘤效果的研究。

4 小結(jié)與展望

醫(yī)源性種植即術(shù)中接觸腫瘤的手套、器械、紗布等相關(guān)物品都可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在手術(shù)區(qū)域的播散種植、切口種植或局部復(fù)發(fā)等。在手術(shù)操作過(guò)程中一定要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)瘤技術(shù)，體腔探查動(dòng)作要輕柔，嚴(yán)禁對(duì)腫瘤進(jìn)行擠壓，探查遵循由遠(yuǎn)及近原則，最后探查原發(fā)腫瘤及受累臟器，探查完畢后，更換手套。研究表明，胸腹腔腫瘤切除術(shù)后沖洗可以減少FTC并且預(yù)防腫瘤胸腹膜種植轉(zhuǎn)移，降低復(fù)發(fā)率，對(duì)提高患者的生活質(zhì)量有明顯作用。但是術(shù)后FTC滅活常因患者耐受性和施術(shù)者的差異，而選擇不同的沖洗液及其沖洗條件。中國(guó)學(xué)者常常在患者手術(shù)后取樣，側(cè)重體內(nèi)研究；國(guó)外學(xué)者常在動(dòng)物試驗(yàn)中探索，偏向于體外模擬。

綜上所述，F(xiàn)TC檢出率與TNM分期、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移類型、病理類型等密切相關(guān)，但是少有研究說(shuō)明這是否會(huì)增加PLC的假陽(yáng)性率。無(wú)論原來(lái)已有的FTC，還是沖洗過(guò)程中增加的FTC，通過(guò)檢測(cè)滅活率都能說(shuō)明沖洗的有效性。但是針對(duì)靈敏度低的FTC檢查假陰性率是否會(huì)增加，已有研究未予以說(shuō)明。沖洗條件如沖洗次數(shù)、溫度會(huì)影響FTC檢出陽(yáng)性率，甚至已有研究得出某些沖洗條件明確范圍，綜合文中所述，這些條件也存在分歧，這就給將來(lái)可重復(fù)性、具體化研究奠定了一定基礎(chǔ)。