PTEN-Long在腫瘤治療中的研究進(jìn)展△

耿連婷，李春暉，單小松，鄭亞北，曾昭穆，鄭克彬#

1河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 保定071000

2河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定0710000

第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是繼p53基因之后又一經(jīng)典的腫瘤抑制基因，在許多腫瘤中存在缺失或突變，如PTEN磷酸酶結(jié)構(gòu)域中的3個(gè)單個(gè)氨基酸突變：C124S（脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性均喪失）、G129E（僅保留蛋白磷酸酶活性而喪失脂質(zhì)磷酸酶活性）和Y138L（僅保留脂質(zhì)磷酸酶活性而蛋白磷酸酶活性喪失）[1-2]。PTEN-L/PTENα、PTEN-M/PTENβ、PTEN-N和PTEN-O是PTEN的4種更長的同工型蛋白產(chǎn)物，它們的起始密碼子均位于PTEN經(jīng)典起始密碼子ATG的上游[3]。PTEN-L是2013年Hopkins等[4]發(fā)現(xiàn)的一種PTEN翻譯變體，與PTEN具有相似的生物活性，發(fā)揮腫瘤抑制的作用，是目前研究的重點(diǎn)。對(duì)于腫瘤的治療存在各種各樣的困難，基因治療目前越來越受到重視。

1 PTEN和PTEN-L的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 結(jié)構(gòu)

PTEN基因位于人類染色體10q23.31上，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N-末端磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）結(jié)合序列（殘基1～7）；雙重特異性磷酸酶結(jié)構(gòu)域（由第14～185位氨基酸組成）和C2結(jié)構(gòu)域（由第190～351位氨基酸組成）；含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的50個(gè)氨基酸C-末端（由第353～400位氨基酸組成）和C端PDZ結(jié)合序列（由第401～403位氨基酸組成）[5]。編碼PTEN的mRNA上翻譯的起始密碼子為ATG，編碼一個(gè)由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。PTEN-L在其N端上游513 bp處選擇了非經(jīng)典翻譯起始密碼子CTG，編碼一個(gè)由576個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對(duì)于PTEN，PTEN-L在其N端多出了173個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為75 kD，并且該173個(gè)氨基酸序列與其他物種預(yù)測(cè)蛋白序列的對(duì)比結(jié)果表明PTEN-L在進(jìn)化過程中高度保守[4]。

1.2 功能

PTEN-L也是一種抑癌基因，在腫瘤細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量較低。與PTEN相似，PTEN-L以磷酸酶活性依賴性的方式通過阻斷磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化水平，并且PTEN-L具有更強(qiáng)的磷酸酶活性。特殊的是，PTEN-L比PTEN多編碼的173個(gè)氨基酸使PTEN-L具有細(xì)胞穿透和細(xì)胞分泌的作用。該額外序列含有多聚丙氨酸序列，似乎起到了通過經(jīng)典途徑發(fā)揮細(xì)胞分泌的作用，而且計(jì)算機(jī)模擬顯示PTEN-L額外序列中含有分泌信號(hào)序列。在細(xì)胞外如細(xì)胞培養(yǎng)基、血漿、血清中可檢測(cè)到PTEN-L的存在。有研究證明，PTEN-L可由細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外。人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的細(xì)胞穿透元件的多堿性殘基。PTEN-L多編碼的173個(gè)氨基酸中具有與該多堿性殘基相似的區(qū)段，使PTEN-L具有穿透細(xì)胞膜的作用，可進(jìn)入相鄰細(xì)胞，并使PTEN-L作為外源藥物或攜帶其他外源藥物影響細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。

2 PTEN-L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

PTEN是在多種類型的腫瘤中存在突變的腫瘤抑制因子，其編碼的蛋白具有雙重特異性磷酸酶的活性，其主要底物是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3）[6]，PTEN可使PIP3去磷酸化，抑制PI3K信號(hào)的傳導(dǎo)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和存活[7]。PTEN-L和PTEN具有相似的生物活性，作為PI3K抑制劑，可通過阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮腫瘤抑制作用，如通過抑制PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、核糖體生物合成、血管生成、自噬及凋亡等過程[8-9]，還可阻斷 PI3K/AKT/核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。PTEN不但可通過阻斷黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，還可通過阻斷促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤的生長和分化，但PTEN-L是否可以通過此途徑發(fā)揮腫瘤抑制作用有待進(jìn)一步研究[10]。

3 PTEN-L前導(dǎo)序列在腫瘤治療中的應(yīng)用及發(fā)展

3.1 PTEN-L前導(dǎo)序列融合蛋白的組裝前景

PTEN-L N-末端的173個(gè)氨基酸被稱為前導(dǎo)序列。PTEN-L前導(dǎo)序列本質(zhì)上是無序的，并且富含翻譯后修飾，可被分泌到細(xì)胞外液中，并可重新進(jìn)入鄰近細(xì)胞或遠(yuǎn)處細(xì)胞，在體內(nèi)和體外發(fā)揮與PTEN相似的腫瘤抑制作用，增加了PTEN治療疾病的可行性[11]。腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）是一種強(qiáng)大的腫瘤抑制因子。研究顯示，將PTEN-L前導(dǎo)序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TP53結(jié)合可組裝為融合蛋白PTEN-L-p53，PTEN-L-p53可被分泌至細(xì)胞外并穿過受體細(xì)胞膜屏障定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。PTEN-L前導(dǎo)序列不影響TP53的功能，PTEN-L-p53可顯著抑制U251細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。該融合蛋白由具有低免疫原性的內(nèi)源性蛋白質(zhì)和內(nèi)源性肽段組成，有希望應(yīng)用于TP53異常的腫瘤治療[12]。用健康的基因取代突變的基因治療疾病是很有前景的[13]，與各種人內(nèi)源蛋白（p53、p16、p21等）融合的PTEN-L前導(dǎo)序列可有效遞送治療性蛋白質(zhì)，避免了傳統(tǒng)載體的缺點(diǎn)，被認(rèn)為是用于遞送治療性蛋白質(zhì)的有效載體，為治療腫瘤提供了一種新穎且直接的方法。

3.2 PTEN-L前導(dǎo)序列工程化版本的構(gòu)建

PTEN在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中多處于失活狀態(tài)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中PTEN活性的恢復(fù)可使腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移減少，同時(shí)對(duì)凋亡的易感性增加。多項(xiàng)研究已對(duì)PTEN活性的恢復(fù)在U87MG細(xì)胞中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，PTEN可抑制U87MG細(xì)胞的增殖、遷移等[14-16]。PTEN-L可通過外泌體或者裸蛋白的形式分泌并被相鄰細(xì)胞攝取，因此，PTEN-L可作為恢復(fù)PTEN活性的治療劑，但是，有效透過血-腦脊液屏障遞送治療性蛋白質(zhì)以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤具有一定的難度，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞具有一定的細(xì)胞歸巢能力[17-20]，如果將這些細(xì)胞工程化以表達(dá)治療性蛋白質(zhì)，則有可能利用這些細(xì)胞的歸巢能力以局部持續(xù)高濃度的方式遞送治療性蛋白質(zhì)。有研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞通過遺傳修飾表達(dá)治療性蛋白質(zhì)可能能夠解決血-腦脊液屏障的問題。另一個(gè)問題是，PTEN-L中的聚氨基酸可能是通過脊椎動(dòng)物進(jìn)化階段的核苷酸重復(fù)擴(kuò)增而產(chǎn)生的。核苷酸的積累可以通過自然選擇優(yōu)勢(shì)來驅(qū)動(dòng)，也可能未通過負(fù)選擇或遺傳漂移而保留下來[21]。這些過程均可能會(huì)限制PTEN-L的細(xì)胞分泌能力和穿透能力。有研究開發(fā)出了一種工程化版本的PTEN-L，它被設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的遞送，具有很強(qiáng)的分泌能力和轉(zhuǎn)移至鄰近細(xì)胞的能力，而這是通過采用來自人輕鏈免疫球蛋白G的前導(dǎo)序列替換PTEN-L的天然前導(dǎo)序列來實(shí)現(xiàn)的[22]。源自人成纖維細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞可以被修飾以表達(dá)PTEN-L，并作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中蛋白質(zhì)遞送的載體[20,23-25]，且能夠?qū)⑤p鏈前導(dǎo)序列PTEN-L（lightchain leader PTEN-L，lclPTEN-L）遞送至鄰近的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。此工程化版本解決了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中由于血-腦脊液屏障引起的藥物吸收障礙的問題，并且穩(wěn)定了PTEN-L前導(dǎo)序列的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮了細(xì)胞介導(dǎo)的蛋白質(zhì)遞送的潛力。

4 PTEN-L在腫瘤治療中的探索

4.1 PTEN-L和tGAS 1的聯(lián)合腫瘤抑制作用

PTEN的表達(dá)產(chǎn)物為雙特異性磷酸酶，具有腫瘤抑制的作用，通過使PIP3去磷酸化來抑制PI3K的活性，還可以獨(dú)立于PI3K調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），是最重要的腫瘤抑制因子之一[26-28]。特異性生長抑制蛋白1（growth arrest-specific 1，GAS1）是一種分子量為37 kD的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤中呈過表達(dá)，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[29]，并明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）誘導(dǎo)的Tyr1062位點(diǎn)的RET的磷酸化，導(dǎo)致AKT磷酸化水平降低，促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)死亡促進(jìn)因子（B cell lymphoma/leukemia-2 associated agonist of cell death，BAD）的去磷酸化和細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase 9和caspase 3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低了ERK1/2的活性[30-32]。GAS1和PTEN均能夠抑制PI3K/AKT和ERK1/2的活性，而且PTEN和GAS1過表達(dá)對(duì)腫瘤的抑制作用具有累加效應(yīng)。tGAS1是一種截短的可分泌的GAS1，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡及自分泌和旁分泌的優(yōu)點(diǎn)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生tGAS1的細(xì)胞及鄰近腫瘤細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大GAS1的有效作用范圍[32-34]，此特點(diǎn)與PTEN-L相似。有研究顯示，通過慢病毒載體同時(shí)過表達(dá)等量的tGAS1和PTEN-L[35]，比單獨(dú)表達(dá)tGAS1和PTEN-L更能有效地抑制U87的生長，且優(yōu)于GAS1和PTEN的抑制腫瘤的作用，降低了AKT和ERK1/2的活性[36]。tGAS1和PTEN-L聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，表明它們?cè)谡T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面具有累加效應(yīng)。

4.2 肝細(xì)胞癌

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是發(fā)生肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的危險(xiǎn)因素。在HCC中經(jīng)常存在PTEN的突變與缺失。研究表明，PTEN-L過表達(dá)后可以抑制HCV的復(fù)制。重要的是，細(xì)胞外PTEN-L蛋白質(zhì)能夠以劑量依賴的方式抑制HCV的復(fù)制。脂質(zhì)磷酸酶活性喪失的G129E突變體可以如野生型PTEN一樣有效地抑制HCV的復(fù)制，而蛋白磷酸酶活性喪失的Y138L和蛋白、脂質(zhì)磷酸酶活性喪失的C124S突變體無法抑制HCV的復(fù)制[37]。將PTEN的某些點(diǎn)突變轉(zhuǎn)移至PTEN-L中的相應(yīng)位置，結(jié)果顯示，C297S和Y311L突變的PTEN-L蛋白不能抑制HCV的復(fù)制，但是，G302E突變的蛋白具有與野生型PTEN-L相同的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，PTEN和PTEN-L中的3種氨基酸的功能在抑制HCV復(fù)制過程中是保守的，HCV核心蛋白通過第50位的精氨酸殘基與PTEN相互作用從而發(fā)揮對(duì)HCV復(fù)制的抑制效應(yīng)[37-38]。有研究顯示，PTEN-L可通過PI3K/AKT途徑抑制HepG2肝癌細(xì)胞的生長[39]。

通常認(rèn)為通過腺病毒將PTEN的cDNA重新引入PTEN基因缺陷的患者體內(nèi)，可以抑制因PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度活化導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生[40]，但是，腺病毒介導(dǎo)的基因治療存在安全隱患，有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)了由腺病毒導(dǎo)致的不良反應(yīng)。因此，PTEN-L蛋白治療可以避免因腺病毒介導(dǎo)所引起的不良反應(yīng)，而且PTEN-L具有與內(nèi)源性蛋白質(zhì)相同的氨基酸序列，避免了免疫原性的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[41-42]。

4.3 腎透明細(xì)胞癌

PTEN-L在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常腎組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中PTEN-L的表達(dá)水平明顯降低，磷酸化的 AKT（phosphorylated AKT，pAKT）的表達(dá)水平明顯升高，二者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在PTEN和PTEN-L的脂質(zhì)磷酸酶活性的作用下，與相應(yīng)的正常腎組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中pAKT的表達(dá)水平幾乎增加了兩倍。PTEN-L活性的下降導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，AKT磷酸化水平升高，進(jìn)而激活一系列下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。另外，該研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，使PTEN-L在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-0中過表達(dá)后阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。將PTEN、PTEN-L純化蛋白質(zhì)加入到無PTEN活性的腎癌細(xì)胞786-0的培養(yǎng)基中，PTEN-L蛋白可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過其脂質(zhì)磷酸酶活性抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但PTEN蛋白并無這樣的效果，并且PTEN-L純化蛋白質(zhì)可抑制異種移植瘤小鼠模型中786-0細(xì)胞的增殖，表明PTEN-L能夠作為蛋白質(zhì)治療劑在體內(nèi)及體外發(fā)揮腫瘤抑制的作用[43]。

4.4 膠質(zhì)細(xì)胞瘤

PTEN-L在人腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要的作用。U87是無PTEN活性的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，避免了內(nèi)源性PTEN在細(xì)胞中的干擾。有研究發(fā)現(xiàn)，采用CRISPR/Cas9基因編輯工具結(jié)合單鏈模板，將編輯PTEN-L的起始密碼子CTG改為ATG，在轉(zhuǎn)染的全細(xì)胞裂解物和濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過Western blot可檢測(cè)到PTEN-L的表達(dá)，而且與野生型U87或?qū)φ张囵B(yǎng)基相比，PTEN-L過表達(dá)可以降低AKT的磷酸化水平，抑制U87細(xì)胞的增殖。表明PTEN-L可以以旁分泌的方式進(jìn)入鄰近細(xì)胞以阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制U87細(xì)胞的增殖[42]。因此，對(duì)于不表達(dá)PTEN或攜帶基因突變的一些腫瘤細(xì)胞，可以在其他細(xì)胞中促進(jìn)PTEN-L的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

5 問題與展望

PTEN-L具有雙特異性磷酸酶活性，其表達(dá)產(chǎn)物可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等，并可通過阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮腫瘤抑制作用，但其他分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。雖然在異種移植瘤小鼠模型中證實(shí)了PTEN-L的治療效果，但仍應(yīng)建立一種前瞻性動(dòng)物模型[43]，即構(gòu)建PTEN-L缺失的動(dòng)物模型，通過與PTEN-L正常表達(dá)的動(dòng)物模型進(jìn)行對(duì)比，研究PTEN-L缺失與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，從病因?qū)W的角度探索PTEN-L的腫瘤抑制作用。

有研究顯示，通過直接在腫瘤內(nèi)注射慢病毒載體可以使tGAS1和PTEN-L過表達(dá)。tGAS1和PTEN-L從細(xì)胞中被釋放出來后通過自分泌和旁分泌的形式擴(kuò)大了GAS1和PTEN的治療范圍[36]。由于蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和釋放發(fā)生于腫瘤內(nèi)，因此認(rèn)為它們?cè)谀[瘤外發(fā)生擴(kuò)散并引起不良反應(yīng)的發(fā)生率很低。但腺病毒介導(dǎo)的基因治療存在安全隱患，會(huì)發(fā)生不同程度的不良反應(yīng)。因此，目前通過以具有腫瘤細(xì)胞歸巢能力的神經(jīng)干細(xì)胞為載體來表達(dá)PTEN-L從而發(fā)揮治療疾病的作用，減少不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。雖然PTEN-L前導(dǎo)序列賦予了PTEN-L直接遞送蛋白質(zhì)的能力，但PTEN-L的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移能力不穩(wěn)定，用人輕鏈IgG的前導(dǎo)序列替換PTEN-L的天然前導(dǎo)序列可增強(qiáng)細(xì)胞的分泌和轉(zhuǎn)移能力，并且可穩(wěn)定PTEN-L前導(dǎo)序列的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移能力，優(yōu)化細(xì)胞介導(dǎo)的蛋白質(zhì)遞送能力[22]。因此，目前通過以神經(jīng)干細(xì)胞為載體表達(dá)人輕鏈IgG前導(dǎo)序列的PTEN-L成為目前的研究趨勢(shì)和重點(diǎn)。

除此之外，PTEN-L的蛋白磷酸酶活性也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，研究表明，PTEN-L可以使pSer65-Ub去磷酸化，該過程抵消了PINK1介導(dǎo)的泛素磷酸化，從而發(fā)揮抑制線粒體自噬的作用。PTEN-L的這種新功能為解決控制線粒體自噬這一問題提供了思路，為涉及此過程的疾?。òㄉ窠?jīng)退行性疾?。┑闹委熖峁┝朔较騕44]，但仍需進(jìn)行相關(guān)具體機(jī)制的探索，為臨床治療提供依據(jù)。PTEN還可以發(fā)揮炎性介質(zhì)的作用，而對(duì)于PTEN-L是否具有此類作用及其相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。綜上所述，PTEN-L不僅在腫瘤的治療中發(fā)揮著重要的作用，在其他相關(guān)疾病的治療中也具有重要的意義。PTEN-L其他的生物學(xué)特性及調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，其可能是基因治療的優(yōu)勢(shì)潛在靶點(diǎn)。