蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因組鑒定、表達和功能分析

黃思源，呼天明，楊培志

（西北農林科技大學草業(yè)與草原學院，陜西 楊凌 712100）

截至目前，已經有許多植物鑒定到PYL家族基因，如在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中鑒定到14個具有高度保守氨基酸序列的PYL基因[9]，在水稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifera)、番茄(Lycopersicon esculentum)、 橡 膠 樹 (Hevea brasiliensis)和 棉 花(Anemone vitifolia)中分別鑒定到 12、8、14、21和27個PYL基因[10-14]，其中一些PYL基因的功能已經被成功驗證，如擬南芥AtPYL4過表達可以增強擬南芥的耐旱性[15]，AtPYL8與AtPYL9在擬南芥?zhèn)雀L中起重要作用[16]，玉米(Zea mays) ZmPYL8、ZmPYL9和ZmPYL12的過表達可以增強玉米的耐寒性[17]，水稻OsPYL5的過表達可以增強水稻對干旱和鹽脅迫耐性[18]。目前，蒺藜苜蓿全基因組測序已經完成[19]，這為用生物信息學手段研究該物種基因家族系統(tǒng)演化及功能分析奠定了基礎，而PYL基因在增強非生物脅迫下的耐受性方面發(fā)揮重要作用。因此，鑒定和驗證蒺藜苜蓿中的PYL基因對理解它們的功能和ABA信號轉導途徑具有非常重要的作用。

本研究利用生物信息學的方法鑒定蒺藜苜蓿中PYL基因家族成員，并分析其基因結構、蛋白結構域、保守基序等信息，同時檢測該基因家族成員在干旱脅迫下的表達模式，旨在為蒺藜苜蓿PYL基因的克隆及功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

用次氯酸鈉將蒺藜苜蓿種子消毒5 min后用蒸餾水沖洗干凈，將處理后的種子放入濾紙覆蓋的培養(yǎng)皿中，放入人工培養(yǎng)箱，在25 ℃/15 ℃(白天/黑夜)進行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)5 d后，將幼苗移栽到裝有石英砂的塑料培養(yǎng)缽 (9 cm × 27 cm)中進一步培養(yǎng)[20]，培養(yǎng)30 d后，將蒺藜苜蓿根部從石英砂中洗出，放置在新的具有干石英砂的塑料培養(yǎng)缽中進行干旱脅迫[21]。采集干旱脅迫0(CK)、3、8 h的蒺藜苜蓿葉片，收集樣品后立即在液氮中冷凍，儲存在-80 ℃冰箱中以備之后進行RNA提取。

1.2 蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因組鑒定與染色體定位

以擬南芥的14個PYL蛋白序列作為查詢序列，在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncbisearch/)通過蛋白質基本局部比對工具設置BLASTp[22]搜索蒺藜苜蓿全基因組，設置檢索閾值E-value為e-6，同時，在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/browse)中下載了Polyketide_cyc2結構域的HMM文件(PF10604)，并利用 HMMER V3.1b2(http://www.hmmer.org)軟件構建隱馬爾科夫模型(HMM)，在蒺藜苜蓿蛋白數據庫搜索含有Polyketide_cyc2結構域的序列，人工去除冗余基因，并通過NCBI-CDD數據庫[23](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)鑒定候選的序列是否具有PYR_PYL_RCAR_like結構域(cd07821)，根據染色體的位置對包括PYR/PYL/RCAR功能域的候選基因進行命名。在蒺藜苜?；蚪M瀏覽器(http://www.medicagohapmap.org/fgb2/gbrowse/mt40/)中鑒定基因序列和位置。在ExPASy[24]網站(http://web.expasy.org/)上鑒定氨基酸數目及等電點(pI)和分子量(MW)。通過YLoc網站[25](http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi)對候選基因進行亞細胞定位預測。使用MapInspect軟件[26]對基因在染色體的分布進行定位，利用MCScanx[27]進行基因家族的復制分析，判定基因復制事件。

1.3 蒺藜苜蓿 PYL基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

使用蒺藜苜蓿、水稻和擬南芥PYL基因的蛋白質序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用MEGA 6.0[28]軟件對蛋白質序列進行序列比對，通過鄰接(NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，設定bootstrap值等于1 000。最后將構建好的樹形圖文件上傳到ITOL[29]網站(http://itol.embl.de/)進行美化，以更好地展示。

1.4 基因外顯子-內含子結構和蛋白質保守基序分析

使用TBtools軟件比較蒺藜苜蓿PYL基因的CDS序列和基因組序列，分析基因外顯子-內含子結構。在MEMEsuite網站[30](http://meme-suite.org/)對候選的蒺藜苜蓿PYL基因鑒定保守基序，設定8個基序的限制。

1.5 MtPYL啟動子中的順式元件分析

從 Ensemble plants網站 (http://plants.ensembl.org/index.html)數據庫獲得蒺藜苜蓿PYL基因起始密碼子(ATG)上游1 500堿基對(bp)內的序列，使用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索啟動子中的順式元件[31]。

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1.6 靶向 MtPYL基因的 miRNA 的預測

在PSRNATarget網站[32](http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)預測潛在的miRNA，采用默認參數。對預測結果使用Cytoscape軟件[33](http://www.cytoscape.org/)進行展示。

1.7 基因表達譜和基因本體富集分析

從蒺藜苜?；虮磉_圖譜(MtgeA)Web服務器[34](http://mtgea.noble.org/v2/)下載蒺藜苜蓿不同組織及鹽脅迫下的PYL基因的表達數據，獲取的表達數據用R語言程序包pheatmap繪制熱圖，使用R語言程序包clusterProfiler[35]進行基因本體(GO)分析及KEGG通路分析，對基因進行功能注釋。

1.8 RNA 提取和實時 qRT-PCR

使用Eastep TM總RNA提取試劑盒(北京普洛麥格生物技術有限公司)從干旱的樣品中提取RNA。使用 1 μg RNA 模板樣品，使用 HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒 (南京諾維贊生物科技有限公司)合成互補DNA的第一鏈(cDNA)。使用LightCycler? 480 II實時熒光定量 PCR 儀進行 qRTPCR測定。

2 結果與分析

2.1 MtPYL基因的全基因組鑒定

根據擬南芥PYL蛋白序列對蒺藜苜?；蚪M進行BLASTp搜索，為了進一步證實這些候選序列的可靠性，通過Pfam數據庫鑒定序列存在Polyketide_cyc2結構域(PF10604)，并通過NCBI-CDD數據庫鑒定序列存在PYR_PYL_RCAR_like結構域(cd07821)。最終在蒺藜苜?；蚪M中鑒定到14種PYL基因家族成員(表1)。根據其在染色體上的位置(表1)，14個成員被命名為MtPYL1-14。

基因在染色體上的分布顯示，14個PYL基因家族成員分布在除2號染色體外的其他7條染色體上，其中在第1、3、5號染色體上分布較多，各有3個PYL基因(圖1)。物理化學分析表明，14個PYL基因家族成員氨基酸的長度在168～233個氨基酸(aa)范圍內，相應的蛋白質分子量在18.5～25.4 kDa，等電點 (PI)在 4.45～7.64。根據 YLoc網站對PYL蛋白亞細胞定位的預測表明，PYL蛋白主要定位在細胞質中。

2.2 蒺藜苜蓿 PYL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

為了確定蒺藜苜蓿PYL基因的進化關系并對它們的分類，對蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻的PYL基因進行進化分析，使用MEGA軟件產生無根的NJ樹。

這3個物種的共40個PYL基因被聚為4組(圖2)。對每組中不同物種的PYL基因的數目進行統(tǒng)計，結果表明，14個蒺藜苜蓿的PYL基因被聚類到所有的組1～4中，每組分別包含4、2、3和5個蒺藜苜蓿PYL基因，擬南芥14個PYL基因被聚類到組1～3中，分別包含3、9和2個基因。水稻的12個PYL基因同樣也是分布到組1～3中，分別包含3、3和6個基因，值得注意的是，組4中的5個基因全部為蒺藜苜蓿PYL基因，根據進化樹發(fā)現，蒺藜苜蓿和擬南芥之間存在幾個密切相關的PYL基因，比如 AtPYL4與 MtPYL13，AtPYL2與MtPYL1等，這暗示它們之間可能具有相似的功能。

表1 蒺藜苜蓿PYL基因家族成員基因組信息和蛋白特征分析Table 1 Analysis of genomic information and characterization of protein encoded by PYL gene family members in Medicago truncatula

圖1 蒺藜苜蓿 PYL 基因的染色體定位Figure 1 Chromosomal mapping of PYL genes in M. truncatula

圖2 3 個植物物種 PYL 蛋白的進化關系Figure 2 Phylogenetic relationship among the PYL proteins of the three plant species

圖3 蒺藜苜?；虻耐怙@子－內含子結構及功能域信息Figure 3 Exon-intron structures and domain information of PYL genes in M. truncatula

2.3 蒺藜苜蓿 PYL基因的結構與功能域分析

功能域預測結果顯示(圖3)，PYR_PYL_RCAR_like結構域存在于所有的14個蒺藜苜蓿PYL基因中，基因外顯子-內含子結構結果(圖3)顯示，蒺藜苜蓿PYL基因的基因結構大多只含有一個外顯子，只有MtPYL2、MtPYL5、MtPYL14具有3個外顯子。結合進化樹，14個蒺藜苜蓿MtPYL基因中，其中10個只有1個外顯子的基因分布于組1，組2和組4中(圖2)，其中，組1和組2的成員全部只有1個外顯子，具有3個外顯子的MtPYL2、MtPYL5、MtPYL14全部落入組3中，而具有兩個外顯子的MtPYL9則落入組4中。而且具有相似外顯子-內含子組織的基因大部分落入同一組中，這進一步支持了本研究中蒺藜苜蓿PYL基因的分類。

2.4 保守基序的分析

使用MEME程序鑒定蒺藜苜蓿PYL基因蛋白質的保守基序，并且通過Smart數據庫進一步預測它們的序列和注釋。結果顯示，在大多數蒺藜苜蓿PYL基因蛋白中鑒定出3個保守的基序(表2、圖4)。保守基序的長度在41～50個氨基酸范圍內，Polyketide_cyc2結構域在蒺藜苜蓿PYL蛋白的保守基序1、2、4、5中被預測(表2)。保守基序1、2在 MtPYL1、MtPYL2、MtPYL4、MtPYL5、MtPYL7、MtPYL8、 MtPYL9、 MtPYL10、 MtPYL13、 MtPYL14中高度保守，保守基序4、5在MtPYL3、MtPYL6、MtPYL11、MtPYL12中高度保守，而MtPYL9只包含保守基序5(圖4)。

表2 蒺藜苜蓿PYL蛋白15中不同的保守基序Table 2 Fifteen different motifs commonly observed in PYL proteins of M. truncatula

圖4 蒺藜苜蓿 PYL 蛋白的保守 motif分布Figure 4 Distribution of conserved motifs of PYL proteins in M. truncatula

2.5 家族內部基因的重復事件分析

分析蒺藜苜蓿PYL基因的重復事件結果顯示(表 3、 圖 5)， MtPYL4-MtPYL10， MtPYL5-MtPYL2，MtPYL2-MtPYL4，MtPYL7-MtPYL13的這4對基因表現為在共線性區(qū)域的共線性基因。MtPYL1，MtPYL3，MtPYL6，MtPYL8，MtPYL9表現為散在重復序列，MtPYL11，MtPYL9表現為染色體附近的重復(不相鄰)，未發(fā)現串聯重復基因(圖5、表3)。

表3 蒺藜苜蓿 PYL 基因重復時間分析Table 3 Analysis of gene duplication time of PYL gene family members in M. truncatula

圖5 蒺藜苜蓿PYL基因在共線性區(qū)域的共線性基因Figure 5 WGD/segmental analysis of PYL gene family members in M. truncatula

2.6 miRNA 分析

近年來，越來越多的人開始關注miRNA與mRNA之間的相互作用，已有研究表明，miRNA主要通過調節(jié)與植物脅迫相關的基因表達來應對外界脅迫。為了解參與蒺藜苜蓿PYL基因調控的miRNA，使用PStarget網站預測出了90個靶向14個蒺藜苜蓿PYL基因的miRNA，并構建了一個關系網絡。分析調控網絡的連接分布，發(fā)現MtPYL1和MtPYL5是成功靶向性最強的蒺藜苜蓿PYL基因，miR2630家族的26個家族成員都靶向MtPYL1和MtPYL5。除此之外，mtr-miR5248被鑒定為靶向兩種蒺藜苜蓿PYL基因(MtPYL11，MtPYL12)，mtr-miR2612被鑒定為靶向4種蒺藜苜蓿PYL基因(MtPYL1、MtPYL4、MtPYL7 和 MtPYL13)(圖 6)。

2.7 順式作用元件分析

順式原件分析結果表明，在蒺藜苜蓿PYL啟動子中鑒定到26種已知的與脅迫和激素相關的順式作用元件。其中 HSE、MBS、TC-rich repeat、LTR、ARE和Box-W1是分別涉及植物對熱、干旱、防御脅迫、低溫、厭氧和真菌誘導反應的原件。分析結果顯示，所有的14種蒺藜苜蓿PYL基因的啟動子序列中至少包含3種參與與應激反應有關的順式元件(圖7)，這表明蒺藜苜蓿PYL基因可能在應對各種脅迫中發(fā)揮重要作用。除此之外，14種蒺藜苜蓿PYL基因的啟動子序列中還包含有0～4種類型的與激素響應有關的順式元件，其中12個基因具有至少1個以上的與激素響應有關的順式元件，包括生長素應答元件(TGA-element)、脫落酸響應元件(AuxRR-core)、乙烯響應元件(ABRE)、赤霉素反應元件(ERE)、水楊酸響應元件(P-box和TCA-element)，這表明蒺藜苜蓿PYL基因可能在對激素的響應中也發(fā)揮重要作用。

2.8 基因本體論 (GO)分析及 PATHWAY 分析

對蒺藜苜蓿PYL基因進行GO分析顯示，14個蒺藜苜蓿PYL基因在細胞成分(CC)類別的細胞質(GO:0005737)中富集，在分子功能(MF)類別的受體活性(GO:0004872)富集。在生物過程(BP)類別的脫落酸激活信號通路(GO:0009738)、信號傳導(GO:0007165)和對外界壓力的響應(GO:0006950)中富集。而KEGG通路分析顯示，蒺藜苜蓿PYL基因主要參與植物激素信號轉導。

圖6 蒺藜苜蓿 PYL 基因與 miRNA 的關系網絡Figure 6 Regulatory network relationships between the putative miRNAs and their targeted MtPYL genes

The green circle is the MtPYLs, the purple circle is the miRNA with the expected 5 expectation, and the red circle is the miRNA with the expected 4 expectation. The smaller the expected value is, the higher the prediction accuracy is.

圖7 蒺藜苜蓿 PYL 基因順式原件分析Figure 7 Cis-acting elements in the promoters of each MtPYL gene

2.9 基因表達模式分析

利用蒺藜苜蓿 M. truncatula Gene Expression Atlas(MtGEA)Web服務器進行的組織表達分析結果表明，14個蒺藜苜蓿PYL基因在數據庫中都有表達數據。聚類圖中用紅－白－藍三色代表基因表達量的多少，紅色色度越高代表基因表達量高，藍色色度越高代表基因表達量越低。結果顯示，MtPYL10與MtPYL14在根中特異性表達，MtPYL4在根中表達量最高，MtPYL1、MtPYL2、MtPYL5、MtPYL6、MtPYL11與MtPYL13在植物的各個組織都普遍表達，MtPYL3、MtPYL8、MtPYL9、MtPYL12 在植株的各個部位表達量都普遍偏低(圖8A)。除此之外，我們還檢測了鹽脅迫下根發(fā)育過程中蒺藜苜蓿PYL基因的表達數據，結果表明，在鹽脅迫下，表達量上調的基因有MtPYL12、MtPYL2和MtPYL5，表達量下調的基因有MtPYL14、MtPYL11、MtPYL13和MtPYL10。

圖8 蒺藜苜蓿PYL基因家族在不同組織中的表達量熱圖(A)和在干旱脅迫下的表達量熱圖(B)Figure 8 Heatmap showing members of PYL gene family in different tissues (A) and expression heatmap under drought stress (B)

2.10 RT-PCR 驗證

通 過 蒺 藜 苜 蓿 M. truncatula Gene Expression Atlas(MtGEA)Web服務器上的表達數據選擇在苜蓿不同部位都有明顯表達的MTRPYL1、MTRPYL6、MTRPYL10、 MTRPYL11、 MTRPYL12、 MTRPYL13、MTRPYL14以及在不同鹽濃度脅迫下具有響應模式的編輯MTRPYL2和MTRPYL5進行輕度干旱(3 h)與重度干旱(8 h)脅迫處理下RT-PCR，檢測基因表達模式。結果顯示，在輕度脅迫下大部分基因表現出顯著下調的趨勢(圖8B)，只有MTRPYL5和MTRPYL6基因表達量顯著上調(P＜0.05)，重度干旱脅迫下大部分基因仍表現出顯著的下調趨勢，只有 MTRPYL2和 MTRPYL12顯著上調 (P ＜0.05)，特別是MTRPYL12上調倍數達5.3倍(圖9)，與蒺藜苜蓿MtGEA Web服務器上的數據表達模式基本類似。

3 討論

圖9 干旱脅迫處理后苜蓿PYL基因家族基因的相對表達量Figure 9 Relative expression of members of MtPYL gene family under drought stresses

植物激素ABA以植物生長和發(fā)育的調節(jié)以及對非生物和生物脅迫的響應兩個功能而聞名[36]。作為ABA受體的PYL是下游ABA信號的第一步[37]，并且是ABA信號轉導途徑中的重要元件。PYL基因家族在許多植物中已鑒定分離出來，本研究是首次鑒定到蒺藜苜蓿中的PYL基因。本研究在蒺藜苜蓿全基因組中鑒定出14個MtPYL基因，與擬南芥中的成員數量相同，多于水稻基因組中PYL的數量(12個)。通過復制事件分析發(fā)現，蒺藜苜蓿PYL基因家族成員中存在共線性區(qū)域的共線性基因，散在重復序列，染色體附近的重復(不相鄰)，未發(fā)現串聯重復基因，推測這可能對蒺藜苜蓿PYL基因家族的擴展具有重要作用。此外，14個PYL蛋白具有不同的蛋白相對分子質量和不同的等電點，表明它們可能在不同的微環(huán)境中發(fā)揮其功能。

通過系統(tǒng)進化和基因結構等分析，蒺藜苜蓿PYL基因可被劃分為4組，這種分類符合之前對擬南芥、水稻、歐洲油菜(Brassica napus)和短柄草(B. sylvaticum)中PYL的系統(tǒng)發(fā)育分析[38]，其中3組中既有擬南芥的PYL基因家族成員，又有水稻的PYL基因家族成員，表明蒺藜苜蓿和擬南芥與水稻之間可能具有類似的進化軌跡。其中同源性較高的基因可能具有相似的功能，例如AtPYL8與MtrPYL12、MtrPYL15具有較高同源性，而AtPYL8基因與植物的側根發(fā)育相關，推測MtrPYL12、MtrPYL15基因也可能與植物的側根生長相關。但蒺藜苜蓿PYL基因在進化上又表現出差異性，暗示了其基因功能的多樣性。通過保守基序分析鑒定出4個保守的基序，保守基序的長度在41～50個氨基酸范圍內，大多數蒺藜苜蓿PYL基因包含兩個保守基序，結合進化樹分析，同一組的蒺藜苜蓿PYL基因具有非常相似的保守基序，這表明蒺藜苜蓿PYL基因具有高度保守的蛋白質結構。亞細胞定位預測顯示蒺藜苜蓿PYL基因主要在細胞質上，這與擬南芥、水稻植物一致[6]，這表明，PYL的功能在不同的植物種類中是保守的。通過GO與KEGG分析發(fā)現，14個蒺藜苜蓿PYL基因在脫落酸激活信號通路、信號傳導和對外界壓力的響應的過程中高度富集，這表明PYL基因在多個生物學過程中發(fā)揮著重要作用。

PYL基因家族作為ABA的受體，參與多種與ABA有關的生理反應，其中AtPYL4、AtPYL8、AtPYL9、 ZmPYL8、 ZmPYL9、 ZmPYL12 和 OsPYL5已經被相關試驗成功驗證。在本研究中，大部分蒺藜苜蓿PYL基因在根、莖、葉片、葉柄、花、莢果和種子等不同組織中廣泛表達，表明它們可能參與多種生理反應，其中鹽脅迫下蒺藜苜蓿PYL基因在根中的表達量與非脅迫條件下有明顯差異，表明蒺藜苜蓿PYL基因可能參與鹽脅迫反應。此外，啟動子順式原件分析顯示在蒺藜苜蓿PYL基因啟動子中檢測到許多與脅迫有關的順式元件，表明蒺藜苜蓿PYL基因的表達可由不同的脅迫誘導。通過RT-PCR分析發(fā)現，只有MTR_PYL5、MTR_PYL6、MTR_PYL2與 MTR_PYL12這 4種基因在干旱條件下顯著上調(P＜0.05)，而大部分基因在受到干旱脅迫時下調表達，推測這可是負反饋調節(jié)機制[39]：當干旱脅迫下大量ABA在葉片中累積時，PYL表達可能被抑制，這進一步表明它們可能參與植物對干旱脅迫的響應過程。

4 結論

本研究在蒺藜苜?；蚪M中鑒定出14個PYL基因家族成員；通過對蒺藜苜蓿PYL基因進行基因結構、進化關系、保守基序和順式原件等分析表明，蒺藜苜蓿PYL基因在植物應對非生物脅迫過程中具有重要作用；qRT-PCR分析結果也表明，蒺藜苜蓿PYL基因在干旱脅迫下具有明顯的表達模式?？傊?，蒺藜苜蓿PYL基因家族作為ABA受體在蒺藜苜蓿抵抗逆境脅迫過程中是有作用的，但各成員的具體功能需要后續(xù)試驗進一步驗證。