甘蔗尾中乳酸菌的分離篩選和鑒定

郭艷霞，楊承劍，彭開屏，唐慶鳳，唐振華，梁 辛，李孟偉，李麗莉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

廣西是我國最大的甘蔗(Saccharum sinense)種植省區(qū)，據(jù)報道，2016年廣西甘蔗種植面積達(dá)108.15萬 hm2，產(chǎn)量占全國甘蔗總產(chǎn)量的60%[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)庫可得，2016年中國甘蔗總產(chǎn)量約為12 306萬 t[2]。甘蔗尾是甘蔗的副產(chǎn)品，指甘蔗頂上2～3個嫩節(jié)和其附帶的整個青綠色葉片，大約占蔗莖重的12%～20%[3]，產(chǎn)量巨大。甘蔗尾的營養(yǎng)成分全面，含糖量高，適口性好，通常作為水牛飼喂的主要青綠飼料來源之一。但是甘蔗的收獲具有季節(jié)性和集中性，加上廣西地區(qū)炎熱潮濕，甘蔗很容易腐敗發(fā)霉，導(dǎo)致了資源的浪費，甘蔗尾飼料化的利用率還不到20%[4]。前人研究報道[5-7]，利用特定的菌類使甘蔗尾發(fā)酵，不僅可以延長甘蔗尾的保存期，而且可以改善其營養(yǎng)價值和提高飼料利用率。甘蔗尾自然發(fā)酵過程主要由乳酸菌利用厭氧環(huán)境，迅速生長產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，從而抑制霉菌等腐敗菌的生長。但是，青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)受到飼料表面附著的乳酸菌數(shù)量、活性和多樣性的影響[8]。目前，研究多集中于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離與鑒定[9-10]，而對于飼草上附著的乳酸菌或是青貯飼料中的乳酸菌的分離篩選鑒定研究報道較少。Pang等[11]對青藏高原地區(qū)的玉米(Zea mays)、苜蓿(Medicago sativa)、三葉草(Trifolium scabrum)、紅豆草(Onobrychis viciifolia)和印度鵝耳草(Eleusine indica)5種主要牧草上自然附著的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，分離出140株乳酸菌，經(jīng)鑒定為5個屬9個種。而對打包自然發(fā)酵的甘蔗尾中附著乳酸菌的研究還尚未見報道。本研究對打包自然發(fā)酵甘蔗尾中的乳酸菌進(jìn)行分離，測定生物學(xué)特性和產(chǎn)酸能力，以期篩選出適合甘蔗尾青貯用的乳酸菌菌株，為新型青貯乳酸菌接種劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗尾樣品：新鮮甘蔗尾采自廣西武鳴縣甘蔗種植戶，進(jìn)行揉搓后打包青貯，每袋約60 kg，分別于第0、15、30、45、60和90天采樣分離。

MRS肉湯瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基(121 ℃，15 min滅菌)購自杭州濱和微生物試劑有限公司，液體石蠟、丙三醇等購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，碳水化合物鑒定試劑條API 50 CH、API 50 CHL培養(yǎng)基購自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型超凈工作臺購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司，GI036T型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋購自廈門致微有限公司，XMTE-8112型電熱恒溫水浴鍋，XMTD-8222型恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，HANNA HI 8424 pH 測定儀購自北京歐信勝科技有限公司，THZ-82A 恒溫振蕩器購自常州國華電器有限公司，ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡購自Nikon日本公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗尾上乳酸菌的分離和純化

打包青貯的甘蔗尾在第0、15、30、45、60和90天分別取樣，各3個重復(fù)。取混合均勻的甘蔗尾樣品10 g加入到90 mL無菌生理鹽水中，在渦旋儀上充分混勻，用無菌生理鹽水稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 個梯度的樣液，每個梯度3個平行。分別取各稀釋度樣液200 μL，用接種環(huán)均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取肉眼可見、生長較快的單個典型菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)過多次分離純化，直至革蘭氏染色鏡檢為單一形態(tài)紫色細(xì)胞，即得到純化的單一菌株。取單一菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃富集培養(yǎng)24 h，進(jìn)行編號，加同體積的40%甘油保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌 API 50 CH 生化試劑盒鑒定

鑒定原理：API 50 CHL主要用于乳酸桿菌和相關(guān)菌的鑒定，試劑盒是有由49種可以發(fā)酵的碳水化合物的API 50 CH試劑條組成。當(dāng)試劑條接種菌液培養(yǎng)時，由于菌種可利用某些碳水化合物產(chǎn)酸，使發(fā)酵液pH下降，指示劑變色。結(jié)果對照反應(yīng)鑒定表或apiweb鑒定軟件。

具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，對菌株培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟參照產(chǎn)品說明書。將提取的乳酸菌基因組DNA送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果拼接后輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，運用BLAST程序?qū)y序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的公開序列進(jìn)行比對(http://blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，選取GenBank中相似性最高的已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再用MEGA4.0軟件采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌產(chǎn)酸能力測定

挑選分離鑒定出的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸能力測定，將保存的菌株先活化，然后將活化好的菌株以5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基里，放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)18 h，然后測定發(fā)酵菌液的pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)特性

從0-90 d打包青貯的甘蔗尾樣品中共分離得到的291株乳酸菌菌株，通過生長產(chǎn)酸試驗，得到產(chǎn)酸能力較強的20株乳酸菌，此20株乳酸菌均分離于青貯第0天(青貯當(dāng)天)，分別編號為Y4、Y12、 Y18、 Y23、 Y24、 Y26、 Y32、 Y33、 Y37、Y40、 Y42、 Y44、 Y45、 Y46、 Y55、 Y56、 Y59、Y61、Y64、Y67。劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，所有的菌株菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢細(xì)胞形態(tài)結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of lactic acid bacteria strains

圖2 乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)Figure 2 Cell morphology of lactic acid bacteria

MRS固體培養(yǎng)基上有單個菌落出現(xiàn)，菌落較小，所有菌落均呈現(xiàn)圓形，乳白色，表面光滑細(xì)密，邊緣整齊，中央微凸起(圖1)。菌株呈短桿狀，單個、成對或短鏈狀存在，無芽孢，革蘭氏染色為紫色，均為陽性菌(圖2)。經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查可初步鑒定為乳酸桿菌。

2.2 乳酸菌API 50 CH生化試劑盒鑒定結(jié)果

從0-90 d打包青貯的甘蔗尾樣品中分離得到乳酸菌菌株20株，培養(yǎng)48 h后，采用乳酸菌API 50 CH 生化試劑盒分析碳水化合物的發(fā)酵結(jié)果 (表1)。根據(jù)API細(xì)菌鑒定金標(biāo)準(zhǔn)中API 50 CH反應(yīng)鑒定表(在孵育48 h后陽性反應(yīng)率)，可初步鑒定出，菌株Y42是L. casei(干酪乳桿菌)，Y32、Y59是L. paracasei(副干酪乳桿菌)，其余的17株是L. plantarum(植物乳酸桿菌)。為了更好地確定菌株的種屬，可進(jìn)一步做16S rDNA基因序列分析。

2.3 乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析鑒定結(jié)果

將分離的20株乳酸菌菌株16S rDNA擴增產(chǎn)物測序結(jié)果同NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST相似性對比分析(表2)。根據(jù)BLAST的比對結(jié)果，下載最相似的已知菌株序列，然后運用BioEdit、Clustalx1.83和Mega4等軟件，以大腸桿菌(Escherichia coli)(NCBI登錄號：X80725)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

分離的20株乳酸菌菌株經(jīng)PCR擴增所或得的16S rDNA 基因部分序列長度為 1 461～1 466 bp。16S rDNA序列Blast比對結(jié)果表明，20株乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列與近緣種基因序列相似度可達(dá)到99%～100%(表2)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可得(圖3)，乳酸菌菌株位于不同的兩大分支，Y32、Y59和Y42聚為一枝，自展支持率達(dá)到77%，結(jié)合碳源發(fā)酵結(jié)果和與近緣種基因序列相似度可達(dá)到99%，可將Y42鑒定為L. casei(干酪乳桿菌)，將Y32、Y59鑒定為L. paracasei(副干酪乳桿菌)。其余的17株乳酸菌菌株聚為一枝，自展支持率為92%，說明他們之間有很近的親緣關(guān)系，結(jié)合碳源發(fā)酵結(jié)果和 BLAST 相似性對比結(jié)果(表2)，可鑒定為L. plantarum(植物乳酸桿菌)。

2.4 乳酸菌產(chǎn)酸能力測定

將分離鑒定出來的20株乳酸菌菌株以5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃條件下，培養(yǎng)18 h后，搖勻測定菌株發(fā)酵液的pH，結(jié)果顯示，這20株乳酸菌菌株發(fā)酵液pH均在3.70以下，Y67菌株發(fā)酵液的pH最低，達(dá)到3.57，其次是Y44，菌株發(fā)酵液pH是3.59(表3)。發(fā)酵液pH最高是菌株Y26和Y18，pH是3.69。說明分離的20株乳酸菌菌株均表現(xiàn)出很好的產(chǎn)酸能力。

表1 甘蔗尾乳酸菌API 50 CH碳源發(fā)酵結(jié)果Table 1 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strains isolated from sugarcane sheaths

續(xù)表 1Table 1 (Continued)

表2 乳酸菌菌株16S rDNA序列Blast比對結(jié)果Table 2 BLAST results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 討論

飼草青貯過程是多種微生物共同作用的過程，主要是飼草表面上附著的乳酸菌，在青貯過程中起著關(guān)鍵性的作用。在青貯發(fā)酵過程中，隨著厭氧和酸性環(huán)境的形成，乳酸菌數(shù)量迅速增加，發(fā)酵體系的pH也逐漸降低，抑制了大部分好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發(fā)酵的微生物的繁殖[12]，使發(fā)酵效果更理想。因此，從青貯飼料中分離篩選出青貯用優(yōu)良乳酸菌，對飼草青貯發(fā)酵具有重要的意義。對分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定的方法除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化特征鑒定外，分子生物學(xué)鑒定是必不可少的方法[13]。在細(xì)菌基因組中，編碼16S rRNA的rDNA基因具有良好的進(jìn)化保守性，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異[14]。16S rDNA基因序列分析方法可作為乳酸菌種屬鑒定最常用的分子學(xué)鑒定方法[15-16]。

圖3 乳酸菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of lactic acid bacteria strains

本研究中從打包青貯的甘蔗尾中分離出了20株乳酸菌菌株，通過傳統(tǒng)的菌落和細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查和碳源發(fā)酵特性對分離乳酸菌菌株做了初步鑒定，然后通過16S rDNA基因序列分析方法對傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)一步驗證，鑒定出了Y42是干酪乳桿菌、Y32和Y59是副干酪乳桿菌，其余17株是植物乳桿菌。也有大量研究表明，這些乳酸菌菌株在飼料和食品發(fā)酵行業(yè)也是優(yōu)勢菌株。楊承劍等[17]從自然堆放發(fā)酵的木薯(Manihot esculenta)渣中分離鑒定出了3株干酪乳桿菌、3株植物乳桿菌、1株丘狀乳桿菌、1株副干酪乳桿菌和1株類布氏乳桿菌，其中植物乳桿菌和干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強，皆可用于木薯渣堆放的發(fā)酵。崔棹茗等[18]經(jīng)傳統(tǒng)微生物鑒定方法和16S rDNA基因序列分析法 ， 從 青 藏 高 原 青 稞 (Hordeum vulgare var. nudum)秸稈青貯飼料中分離出了1株乳酸片球菌、1株戊糖片球菌和2株植物乳酸菌，其中植物乳酸菌的產(chǎn)酸能力最強。楊子燕等[19]從云南省各地區(qū)發(fā)酵樣品中分離出的120株干酪乳桿菌，篩選出4株耐酸耐鹽并且能抑制腸道致病菌的干酪乳桿菌，對活性乳酸菌飲品的生產(chǎn)具有重大意義。由此可見，本研究從甘蔗尾中分離出了20株乳酸菌菌株作為青貯發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，有潛力成為青貯飼料的乳酸菌添加劑。

表3 乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力Table 3 Acid production of lactic acid bacteria strains

產(chǎn)酸能力直接影響青貯產(chǎn)品的品質(zhì)，也是優(yōu)質(zhì)乳酸菌篩選的一個重要指標(biāo)。Medonald等[20]和Woolford[21]提出，作為青貯發(fā)酵劑的優(yōu)質(zhì)乳酸菌應(yīng)具有均一發(fā)酵途徑，在厭氧條件下利用飼料中的碳水化合物，如乳糖、葡萄糖、果糖等各種糖類，尤其是戊糖，快速發(fā)酵產(chǎn)生大量有機酸，從而快速降低發(fā)酵體系的pH，使pH降到4.0以下，以抑制其他微生物的生長。本研究中篩選出的20株乳酸菌菌株在培養(yǎng)18 h后pH均可降到3.70以下，說明產(chǎn)酸能力較強。楊承劍等[17]從木薯渣中分離的4株乳酸菌發(fā)酵液在6 h內(nèi)pH降低幅度較大，15 h后均可降到4.0以下，其中植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強，pH是3.50。本研究分離的植物乳桿菌pH也可達(dá)3.57。20株乳酸菌發(fā)酵液pH均在3.70以下，具有良好的青貯潛能，給優(yōu)良的青貯飼料添加劑的開發(fā)和制備提供了依據(jù)，但是多種菌株如何搭配使用和添加劑量多少的確定方面，以及是否可以大規(guī)模化利用及產(chǎn)品化等方面的研究，還需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本研究從打包青貯的甘蔗尾中分離篩選出了20株乳酸菌菌株，經(jīng)鑒定得到干酪乳桿菌1株，副干酪乳桿菌2株，植物乳酸桿菌17株。這20株菌株產(chǎn)酸能力較強，培養(yǎng)18 h后菌株發(fā)酵液pH可將至3.70以下，Y67菌株的pH最低，為3.57。本研究通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)分析方法，對打包青貯的甘蔗尾上的乳酸菌進(jìn)行了分離篩選和鑒定，此20株菌株均可用于甘蔗尾飼料的青貯發(fā)酵，為甘蔗尾或其他飼料青貯添加劑的開發(fā)提供了依據(jù)。