1BL/ 1RS易位系HMW-GS組成與品質(zhì)分析

李亞青，張 楠，張士昌，何明琦，李孟軍

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院/河北省小麥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050041)

1BL/1RS易位系是由黑麥的1RS染色體短臂取代普通小麥的1BS染色體短臂形成的，1BL/1RS易位廣泛存在于世界各地的小麥基因組中，在我國(guó)小麥育種和生產(chǎn)中也占有重要的地位[1-3]。黑麥1RS染色體短臂替代小麥1BS 染色體短臂給小麥帶來抗逆性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性的同時(shí)，也導(dǎo)致其烘烤加工品質(zhì)變差，主要表現(xiàn)為面團(tuán)粘性增加、面筋強(qiáng)度減弱、面團(tuán)形成時(shí)間顯著變短、最大抗延阻力降低、面團(tuán)延伸性增加和面包體積減小等[4-5]。1BL/1RS易位使 1BS上編碼低分子量麥谷蛋白亞基的位點(diǎn)Glu-3和編碼γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位點(diǎn)Gli-1喪失，導(dǎo)入了1RS 上編碼γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的Sec-1位點(diǎn)。Sec-1位點(diǎn)編碼的γ-黑麥堿、ω-黑麥堿不能補(bǔ)償Glu-3、Gli-1編碼的低分子量麥谷蛋白和γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的品質(zhì)效應(yīng)，引起麥谷蛋白聚合物結(jié)構(gòu)的改變和數(shù)量的減少，給1BL/1RS 易位系的SDS 沉降值、和面時(shí)間、面團(tuán)延伸性、耐揉性和抗延阻力等加工品質(zhì)性狀帶來顯著負(fù)面效應(yīng)[4,6-7]。Sec-1位點(diǎn)編碼的ω-黑麥堿高度親水，致使面團(tuán)的吸水性增大，持水性降低，面團(tuán)的穩(wěn)定性和延伸性降低，從而導(dǎo)致1BL/1RS 小麥烘烤和蒸煮品質(zhì)下降[8-9]。因此，消除ω-黑麥堿的不良影響是解決1BL/1RS易位系小麥面團(tuán)不良加工品質(zhì)的重要途徑之一。解決ω-黑麥堿對(duì)面團(tuán)加工品質(zhì)不良影響途徑主要包括：(1)導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)HMW-GS。優(yōu)質(zhì)HMW-GS的導(dǎo)入可在一定程度上彌補(bǔ)由ω-黑麥堿基因造成的不良影響[10]。(2) 用1BS上含有Glu-3位點(diǎn)和Gli-1位點(diǎn)的區(qū)段置換1RS上含有Sec-1位點(diǎn)的區(qū)段。這種策略周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，被置換的黑麥的染色體區(qū)段可能包括一些對(duì)其他性狀有益的基因。(3) 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)沉默ω-黑麥堿基因家族。ω-黑麥堿基因沉默的轉(zhuǎn)基因株系的面筋指數(shù)、沉降值和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間均顯著提高，而其農(nóng)藝性狀，如株高、穗粒數(shù)、千粒重和小區(qū)產(chǎn)量均未受到不良影響[11]；這種策略存在轉(zhuǎn)基因后代沉默性狀是否多代穩(wěn)定遺傳以及轉(zhuǎn)基因小麥在育種和生產(chǎn)上無法推廣的問題。(4)利用誘變技術(shù)敲除1RS上含有Sec-1位點(diǎn)的區(qū)段。本課題組利用A-PAGE技術(shù)篩選石麥15重離子束誘變的突變體庫，獲得了ω-黑麥堿缺失突變體株系A(chǔ)94；石麥15的面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為1.2～1.4 min，而株系A(chǔ)94的面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為3.0～3.2 min。

本研究利用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)300份1BL/1RS小麥易位系材料的HMW-GS組成進(jìn)行解析，并采用DA7200近紅外成分分析儀對(duì)其籽粒主要品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，以深度挖掘1BL/1RS易位系的育種潛力，明確優(yōu)質(zhì)HMW-GS對(duì)小麥加工品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)技術(shù)從石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院小麥所馬蘭試驗(yàn)站和河北省農(nóng)林科學(xué)院小麥資源室保存的1 850份小麥品種(系)中鑒定出1BL/1RS易位系482份。在石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院院部試驗(yàn)地對(duì)482份材料連續(xù)進(jìn)行了4年(2011-2015年)農(nóng)藝性狀觀察和純系選擇，選取在該地區(qū)田間表現(xiàn)良好的300份材料進(jìn)行HMW-GS組成與品質(zhì)分析。

1.2 小麥1BL/1RS易位系鑒定

采用A-PAGE技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)供試材料進(jìn)行鑒定[12-14]。1RS特異性引物AF1/AF4和1BS特異性引物GluB3見表1。PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix(GenStar)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板基因組DNA 2 μL(50 ng·L-1)，ddH2O 6 μL。 PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,退火 30 s,72 ℃ 2 min/1min，35個(gè)循環(huán)。Taq Polymerase 為2×Taq PCR StarMix(GenStar)。

1.3 小麥HMW-GS組成和品質(zhì)分析

每個(gè)小麥品種的HMW-GS蛋白提取及其SDS-PAGE分析參照魏 樂、朱金寶和 Morel等[15-17]的方法。每個(gè)材料取3粒種子分別磨碎，加入200 μL蛋白提取液(0.062 5 mol·L-1Tris-HCl，pH 6.8，5% 巰基乙醇，2% SDS,20%丙三醇，0.002%溴酚藍(lán))，過夜后沸水浴2 min,12 000 r·min-1離心5 min，取上清備用。電泳采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠濃度8.7%，濃縮膠濃度4.8%，交聯(lián)度均為2.67%；緩沖液:25 mmol·L-1Tis-HCl，192 mmol·L-1甘氨酸，0.1%SDS，pH 8.8；100 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)移動(dòng)至凝膠底部，停止電泳，染色過夜(10%冰醋酸，25%乙醇，0.01%考馬斯亮藍(lán)R250)。脫色(10%冰醋酸，25%乙醇)至蛋白條帶清晰，照相保存。

表1 1BL/1RS易位系檢測(cè)引物Table 1 Primers for identification of 1BL/1RS translocation wheat accessions

亞基命名參照Payne 和Lawrence[18]的命名系統(tǒng)。采用DA7200近紅外成分分析儀對(duì)小麥籽粒主要品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定[19-20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 1BL/1RS易位系鑒定

黑麥醇溶蛋白電泳譜上1RS 有1組特征帶，此特征帶為Gli-B1l位點(diǎn)的表達(dá)產(chǎn)物[21]，因此小麥醇溶蛋白Gli-B1l可作為1RS/1BL易位系的標(biāo)記[22]。A-PAGE電泳圖譜顯示，300份小麥材料醇溶蛋白ω區(qū)均具有1RS Gli-B1l特征條帶(圖1)。用引物AF1/AF4在300份材料中均可擴(kuò)增出1 500 bp條帶，用引物GluB3未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶出現(xiàn)。推測(cè)300份材料均具有黑麥1RS染色體，均為1BL/1RS 易位系。

A:醇溶蛋白A-PAGE電泳；B:1RS特異引物AF1/AF4 PCR擴(kuò)增；C:1BS特異引物GluB3 PCR擴(kuò)增；M:DNA marker DL2000；1:山農(nóng)914453；2:河農(nóng)6049；3:邯早1號(hào)；4:邯原1號(hào)；5:冀曲麥12；6:萊州3279；7:萊州137；8:石新731；9:金豐4198；10:石麥18；11:石麥15；12:藳優(yōu)2018；13:師欒02-1；14:ddH2O

A:Gliadins separated on A-PAGE; B:PCR products amplified with 1RS specific primer AF1/AF4; C:PCR products amplified with 1BS specific primer GluB3；M:DNA marker DL2000; 1:Shannong 914453; 2:Henong 6049; 3:Hanzao 1; 4:Hanyuan 1; 5:Jiqumai 12; 6:Laizhou 3279; 7:Laizhou 137; 8:Shixin 731; 9:Jinfeng 4198; 10:Shimai 18; 11:Shimai 15; 12:Gaoyou 2018; 13:Shiluan 02-1; 14:ddH2O

圖11BL/1RS易位系小麥鑒定

Fig.1Identificationof1BL/1RStranslocationwheataccessions

2.2 HMW-GS分析

在300份1BL/1RS易位系中檢出12種HMW-GS類型。Glu-A1位點(diǎn)檢出2種亞基(Null、1)，Null和1亞基出現(xiàn)頻率分別為47.67%和52.33%；Glu-B1位點(diǎn)檢出7種亞基類型(6+8、7、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18)，以7+9亞基頻率最高，達(dá)到58.67%，優(yōu)質(zhì)亞基7+8、14+15和17+18的頻率分別為11.00%、17.00%和9.67%；Glu-D1位點(diǎn)檢出3種亞基類型(2+12、5+10、5+12)，2+12亞基出現(xiàn)的頻率最高，為71.33%；優(yōu)質(zhì)亞基5+10和5+12的頻率分別為16.00%和12.67%(表2)。

300份1BL/1RS易位系中檢出27種HMW-GS組合。組合Null/7+9/2+12的頻率最高，為31.67%；其次是組合1/7+9/2+12，頻率為16.00%；組合1/14+15/2+12的頻率為8.67%，其余24種組合出現(xiàn)的頻率均小于5%。從沉降值、烘烤品質(zhì)和面團(tuán)強(qiáng)度等方面考慮，在27種HMW-GS組合中有4種優(yōu)質(zhì)亞基組合，分別為1/7+8/5+10、1/7+9/5+10、1/14+15/5+10、1/17+18/5+10[23-25]。具有這4種優(yōu)質(zhì)亞基組合的1BL/1RS易位系共有31份，出現(xiàn)頻率為10.33%(表3)。300份1BL/1RS易位系的HMW-GS類型豐富，其亞基組合也呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性。

表2 1BL/1RS易位系 Glu-1位點(diǎn)HMW-GS組成與頻率Table 2 Composition and frequencies of HMW-GS encoded by Glu-1 loci in 1BL/1RS translocation lines

表3 1BL/1RS易位系HMW-GS組合及頻率Table 3 Composition and frequencies of HMW-GS in 1BL/1RS translocation wheat accessions

2.3 品質(zhì)性狀

300份1BL/1RS易位系的品質(zhì)性狀呈現(xiàn)出明顯差異。延展性、蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、硬度和沉降值5項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)較大，其中，沉降值變異系數(shù)最大，為20.70%；容重的變異系數(shù)最小，僅為1.16%(表4)。

表4 1BL/1RS易位系的品質(zhì)性狀Table 4 Quality performance of 1BL/1RS translocation wheat accessions

小麥烘焙品質(zhì)與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值正相關(guān)[25-26]。進(jìn)一步結(jié)合HMW-GS組成分析，在300份易位系中有9份有較高的品質(zhì)育種價(jià)值(表5)，其HMW-GS組合均為優(yōu)質(zhì)亞基組合，其中5份的亞基組合為1/7+8/5+10，4份的亞基組合為1/7+9/5+10。 臨遠(yuǎn)3158、寒24和煙農(nóng)18的蛋白質(zhì)含量分別為11.82%、11.88%和12.17%，蛋白質(zhì)含量基本達(dá)到弱筋小麥標(biāo)準(zhǔn)。這9份材料為1BL/RS易位系在育種中的應(yīng)用提供了新的候選親本。

表5 優(yōu)良1BL/1RS種質(zhì)資源Table 5 Germplasms of 1BL/1RS translocation wheat accessions with good quality

3 討 論

1BL/1RS的1RS不但具有抗條銹病(Yr9)、葉銹病(Lr26)、稈銹病(Sr31)和白粉病(Pm8)基因[1],而且攜帶提高小麥產(chǎn)量和增強(qiáng)對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的基因，因此1BL/1RS易位系在小麥抗病、抗逆和產(chǎn)量等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性[1-2]。但是，Sec-1位點(diǎn)的引入和Glu-3、Gli-1位點(diǎn)的缺失，導(dǎo)致1BL/1RS易位系加工品質(zhì)下降[4-7]。近年來，在小麥育種中對(duì)品質(zhì)的重視程度不斷提高，1BL/1RS易位系在小麥育種中的利用受到很大的限制。為了更好利用1BL/1RS易位系，挖掘其育種潛力，有必要對(duì)現(xiàn)有的1BL/1RS易位系資源進(jìn)行深入研究，尋找在小麥品質(zhì)育種具有應(yīng)用價(jià)值的1BL/1RS易位系。

HMW-GS的組成與小麥面粉的理化性質(zhì)如彈延性及沉淀值等密切相關(guān)[18]。優(yōu)質(zhì)HMW-GS組合可以補(bǔ)償1RS上Sec-1表達(dá)的ω-黑麥堿造成的小麥加工品質(zhì)的降低[10]。因此，檢出具有優(yōu)質(zhì)亞基組合的1BL/1RS易位系，并進(jìn)一步分析其品質(zhì)及其遺傳規(guī)律，有助于促進(jìn)1BL/1RS易位系在小麥品質(zhì)育種中的應(yīng)用。普通小麥1AL、1BL 和 1DL 上分別具有Glu-A1、Glu-B1和Glu-D13個(gè)編碼 HMW-GS 的基因位點(diǎn)，統(tǒng)稱為Glu-1[18]。亞基1、2*、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18和5+10對(duì)小麥加工品質(zhì)有正向效應(yīng)，屬于優(yōu)質(zhì)亞基[23-25]。本研究中，1BL/1RS易位系Glu-A1位點(diǎn)編碼2種HMW-GS，其中優(yōu)質(zhì)亞基1占比為52.33%；Glu-B1位點(diǎn)編碼 8種亞基組合，其中4種優(yōu)質(zhì)亞基(7+8、13+16、14+15、17+18)總計(jì)占比38.34%；Glu-D1位點(diǎn)編碼4種HMW-GS，其中優(yōu)質(zhì)亞基5+10占比16.00%。在300份1BL/1RS易位系中，有31份在3個(gè)位點(diǎn)上均編碼優(yōu)質(zhì)亞基，但其品質(zhì)呈現(xiàn)明顯差別，其中僅9份表現(xiàn)較好。亞基組成相同的小麥品種品質(zhì)有較大差異,這說明小麥品質(zhì)除了與亞基組成有關(guān)外,還受亞基含量等其他因素的影響[27]。1BL/RS易位系的品質(zhì)性狀及其品質(zhì)育種價(jià)值有待更深入研究。

本研究中，300份1BL/1RS易位系容重和吸水率的變異系數(shù)較小，而其他5項(xiàng)指標(biāo)的變異范圍較大。鄭91138、淮麥0606、嘉麥4號(hào)、陜農(nóng)78、濟(jì)997884、煙2801、煙0401、邯優(yōu)1號(hào)和滄麥028 有較高的品質(zhì)育種價(jià)值。這些材料Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)均編碼優(yōu)質(zhì)亞基，同時(shí)具有較好的蛋白質(zhì)品質(zhì)。