肝內(nèi)膽管癌分子水平研究進(jìn)展

李雪鵬，劉蘇來，蔣波

[湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科（湖南省衛(wèi)生健康委員會(huì)膽道疾病研究中心；湖南省膽道疾病防治臨床醫(yī)療技術(shù)研究中心；湖南師范大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；湖南省人民醫(yī)院膽道疾病研究室；湖南省人民醫(yī)院膽道外科研究室），湖南 長(zhǎng)沙 4100020]

膽管癌是指源于膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤，過去10年間發(fā)病率增加近20%，根據(jù)其發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）、肝門部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌[1-7]。ICC是指源自肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約占膽管癌的10%。ICC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素主要有肝膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝炎病毒感染（乙型與丙型）、肝硬化、肥胖和飲酒等[8]。ICC臨床癥狀因發(fā)生部位不同而異；末梢型膽管癌早期多無臨床表現(xiàn)，晚期可有上腹部隱痛、肝大、體質(zhì)量下降等癥狀。ICC惡性程度高，具有極強(qiáng)的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特性。ICC早期診斷困難，許多患者確診時(shí)已屬中晚期。手術(shù)治療是目前治愈膽管癌唯一可能的方法，但I(xiàn)CC根治性手術(shù)后5年生存率僅有9.5%[9]。隨著腫瘤分子學(xué)的發(fā)展，已有諸多腫瘤可通過分子標(biāo)記物檢測(cè)達(dá)到早期診斷和指導(dǎo)治療的目的。本文綜述ICC相關(guān)分子標(biāo)記物的研究現(xiàn)狀和最新進(jìn)展。

1 ICC 遺傳學(xué)分子研究多聚焦于基因的變化

腫瘤分子遺傳學(xué)是研究生物大分子及其產(chǎn)物與癌的關(guān)系，包括癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物，腫瘤微環(huán)境與癌癥的關(guān)系；原癌基因在人體內(nèi)呈低表達(dá)狀態(tài)，并發(fā)揮重要的生理功能；原癌基因被激活后大量表達(dá)，發(fā)生序列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。抑癌基因具有拮抗原癌基因作用，維持正負(fù)調(diào)節(jié)的相對(duì)穩(wěn)定，抑癌基因失去作用時(shí)可發(fā)生癌變。近幾年來，發(fā)現(xiàn)了一些ICC相關(guān)原癌基因、抑癌基因以及腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子。

1.1 抑癌基因

1.1.1 p53 基因 定位于人類17 號(hào)染色體，含有11 個(gè)外顯子。p53 調(diào)控細(xì)胞周期G1和G2/M。p53基因發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)將會(huì)失去調(diào)控，從而誘導(dǎo)腫瘤形成。P53 蛋白可引起細(xì)胞周期停滯并上調(diào)Bax 表達(dá)水平以及下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。p53 常失去雜合性及發(fā)生鈍化突變導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞癌變[10]。王新根等[11]通過收集膽管癌52 例，其中ICC48 例，肝外膽管癌（ECC）4 例，選取非腫瘤性疾病膽囊及肝內(nèi)膽管增生病例26 例作為對(duì)照組研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌及對(duì)照組p53 表達(dá)率分別為89%、54%，然而在中等以上表達(dá)強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)中則膽管癌組表達(dá)率約60%，對(duì)照組則低至8%。

1.1.2 p16 基因 是存在于染色體9p21 上的抑癌基因，P16 蛋白的作用是能與cyclin D1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 CDK4，阻止細(xì)胞進(jìn)入G1/S 期，從而抑制細(xì)胞過度增殖。當(dāng)p16 基因發(fā)生變異時(shí)，細(xì)胞將失去這種抑制作用而出現(xiàn)無限增殖和惡性轉(zhuǎn)化。Ishikawa等[12]根據(jù)膽管上皮內(nèi)瘤變的程度分組后發(fā)現(xiàn)，隨著上皮內(nèi)瘤變級(jí)別的升高，p16 的表達(dá)率逐漸降低，p16 的缺失將加快腫瘤的形成。谷化平等[13]報(bào)道，膽管癌中P16 蛋白陽性表達(dá)率為42.0%，明顯低于正常膽管上皮的90.0%（P＜0.05）。有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，p16 的失表達(dá)現(xiàn)象在ICC 比ECC 中更常見。

1.1.3 BRCA1相關(guān)蛋白1（BRCA1-associated protein 1，BAP1）基因BAP1基因定位于人染色體3p21，其編碼的產(chǎn)物BAP1 由729 個(gè)氨基酸組成的去泛素化酶, 可作用于H2A、HCF、INO80、KLF5、MCRS1、r-tubulin 以及BAP1 自身，如BAP1 可去泛素化宿主細(xì)胞因子1 進(jìn)而解除宿主細(xì)胞因子1 對(duì)E2F 反應(yīng)性啟動(dòng)子活性的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖[15]。BPA1 是腎癌、眼部腫瘤、膽管癌、間皮瘤等腫瘤的抑癌基因。最近相關(guān)專家提出BAP1 突變傾向于肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌。Andric 等[16]對(duì)211 例ICC 患者進(jìn)行了BAP1 免疫組織化學(xué)檢查，研究顯示26% 的ICC中BAP1 存在突變。這結(jié)果與Jiao 等[17]報(bào)告的失活突變的發(fā)生率非常相似。最近一次研究[18]也發(fā)現(xiàn)BAP1 的低表達(dá)促進(jìn)了ICC 細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力。

1.1.4 DPC4/SMAD4 DPC4 基因，又稱SMAD4基因位于染色體18q21.1 上，其編碼的SMAD4 蛋白的主要作用是參與了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族的信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)。TGF-β 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在組織的發(fā)育、再生修復(fù)中起重要作用。DPC4/SMAD4 基因的表達(dá)缺失使得TGF-β 通路基因轉(zhuǎn)錄失活，造成腫瘤形成。另外DPC4 還有下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管的生成的作用。DPC4/SMAD4 基因的突變?cè)谑彻馨19]、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[20]、胰腺導(dǎo)管腺癌[21]都有報(bào)道。然而在ICC 方面研究較少，Lee 等[22]采用免疫組化和PCR 技術(shù)檢測(cè)正常膽道細(xì)胞和膽管癌的DPC4/SMAD4 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膽管癌的表達(dá)缺失率明顯高于正常膽管細(xì)胞。但并不影響DPC4/SMAD4 突變靶點(diǎn)作為治療ICC 的一個(gè)新的思路。

1.2 原癌基因

1.2.1 Ras 致癌基因家族 包括H-ras、K-ras 和N-ras，其功能是可編碼具有GTP 酶活性的P21 蛋白。當(dāng)Ras 基因突變時(shí)，P21 蛋白的GTP 酶活性減弱，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等起到重要調(diào)節(jié)作用。膽管癌相關(guān)的Ras 基因主要是K-ras基因。Chen 等[23]對(duì)86 例ICC 手術(shù)患者資料進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，K-ras 基因突變是ICC 患者預(yù)后的重要指標(biāo)。伴有該基因突變的手術(shù)患者，術(shù)后中位生存時(shí)間為5.9 個(gè)月，而不伴該基因突變的患者生存時(shí)間為19.0 個(gè)月。

1.2.2 c-erbB-2又稱為neu基因或HER-2 基因：定位在17q21 染色體上，其編碼的P185 蛋白具有酪氨酸激酶活性 , 在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)中起調(diào)劑作用[24]。文獻(xiàn)[25]報(bào)道，c-erbB-2 過度表達(dá)可以激活信使系統(tǒng)，促使細(xì)胞增殖失控, 其過表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)。鄭軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)原癌基因c-erbB-2 在21 例原代培養(yǎng)人膽管癌細(xì)胞中有 18 例（86%）表達(dá)陽性，3 例表達(dá)陰性，6 例原代培養(yǎng)人正常膽管細(xì)胞中c-erbB-2 蛋白的表達(dá)均為陰性。表明c-erbB-2 在膽管癌中高表達(dá)。

1.2.3 C-ROS癌基因1（c-ROS-oncogene 1，ROS1） 定位于人體第6 號(hào)染色第q22 區(qū)，編碼酪氨酸蛋白激酶。當(dāng)ROS1 基因編碼異常時(shí)，可致持續(xù)激活ROS1 酪氨酸激酶區(qū)及下游PI3K/AKT/mTOR、JAK 等信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。有研究[27]發(fā)現(xiàn)約有9% 的膽管癌組織中發(fā)現(xiàn)ROS1 基因突變。朱壘等[28]對(duì)ICC 細(xì)胞株中ROS 蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，ROS 融合基因陽性表達(dá)率較低。但在ICC 中，ROS 融合蛋白仍是一種強(qiáng)有力的腫瘤蛋白。越來越多的研究也表明ROS融合基因一個(gè)有效治療ICC 靶位點(diǎn)。

1.2.4 異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）1和2（IDH1/IDH2） IDH1/IDH2 是催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸的酶（α-ketoglutarate，α-KG）、還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。IDH1/2 突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)由α-KG 生成的2-羥基戊二酸（hydroxyglutarate，2-HG）。由于2-HG 可競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-KG 依賴性酶使得DNA 和組蛋白的異常高甲基化。IDH1/2基因突變發(fā)生在各種類型的惡性腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤[29]，軟骨肉瘤[30]，ICC[31]和急性骨髓性白血病[32]。IDH 突變導(dǎo)致2-HG 水平上調(diào)，促使HIF1α 活性增強(qiáng)，從而使得DNA 及組蛋白處于高甲基化狀態(tài)，可能是導(dǎo)致膽管癌發(fā)生發(fā)展的原 因[33]。以往認(rèn)為IDH1/IDH2 突變?cè)趯?shí)體器官腫瘤中很少見[34]。然而，最近幾次突變圖譜的研究[35-37]表明，IDH 突變是膽管癌較常見的基因畸變。且ICC 相對(duì)ECC 常見。

綜上，目前ICC發(fā)現(xiàn)的突變腫瘤抑制基因主要有ARID1A、ARID1B、BAP1、PBRM1、TP53、STK11和PTEN，以及致癌基因，即IDH1、IDH2、KRAS、BRAF和PIK3CA[38]。根據(jù)ICC的DNA基因突變情況，因而針對(duì)ICC的靶向治療有多種可選擇的靶點(diǎn)，而目前有大量相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，其中部分研究已顯示了較好的苗頭[39]。

2 miRNA 在ICC 中的研究進(jìn)展

在2001年人類基因組測(cè)序完成后，研究人員發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)編碼序列僅占人類基因組的2%，其剩余98%的序列為非編碼序列，僅能轉(zhuǎn)錄成RNA而不被翻譯為蛋白質(zhì)[40]。隨著近年來高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA。miRNA為DNA在轉(zhuǎn)錄過程中，能轉(zhuǎn)錄但不被翻譯成的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度約20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA。miRNA通過與目標(biāo)mRNA堿基完全或近乎完全的互補(bǔ)可誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解，而部分互補(bǔ)則通過阻斷核糖體與mRNA結(jié)合而抑制mRNA的翻譯，從而阻止相關(guān)基因的表達(dá)[41]。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化等方面起重要的調(diào)控作用。

miRNA在ICC的發(fā)病中具有重要作用，如miR-31[42]、miRNA-320[43]、miR-29[44]等在腫瘤的增殖和抗凋亡中起重要作用。Mott等[45]發(fā)現(xiàn)miR-29在膽管癌中呈低表達(dá)，其抑癌機(jī)制為m i R-2 9 抑制Mcl-1促進(jìn)腫瘤壞死因子引起的凋亡；miR-29 表達(dá)下調(diào)可能與c-Myc、Hedgehog及NF-к B等通路的開放相關(guān)[44]。多種miRNA與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如miR-21[46-48]、miR-124[49]、 miR-214[50]、miR376c[51]等在ICC與腫瘤的轉(zhuǎn)移有些密切的關(guān)聯(lián)。肝吸蟲相關(guān)性膽管癌中發(fā)現(xiàn)miR-21通過PDCD4、TIMP3具有促進(jìn)增殖作用[52]。Liu等[53]對(duì)膽管癌RBE及QBC939兩種細(xì)胞株進(jìn)行miRNA-122對(duì)照實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miRNA-122過表達(dá)對(duì)兩種細(xì)胞株具有促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移能力的作用。Li等[54]發(fā)現(xiàn)miR-221作用于PTEN形成β-catenin/c-Jun閉環(huán)通路，正反饋促進(jìn)膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。由于miRNA表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)，因此，以這些異常的miRNA為靶點(diǎn)可能是治療ICC有效的策略。miRNA相關(guān)片段在ICC中的作用見表1。

表1 miRNA 相關(guān)片段在ICC 中的作用Table 1 Actions of the relevant miRNAs in ICC

3 蛋白修飾

蛋白修飾多在蛋白-N末端，如乙?；?、甲基化、磷酸化等共價(jià)修飾，這些修飾使得基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生改變；這些蛋白修飾與DNA抑制與失活相關(guān)。蛋白脫乙?；福℉DAC）是組織蛋白修飾中比較重要的部分；多種惡性腫瘤中HDAC均有過表達(dá)的現(xiàn)象，如乳腺癌中HDAC-1，結(jié)腸癌中HDAC-2/3均存在過量表達(dá)，膽管癌中HDAC也具高表達(dá)狀態(tài)，HDAC-1的過度表達(dá)與ICC惡性程度、和預(yù)后差相關(guān)[56]。朱鵬等[57]運(yùn)用HDAC抑制劑曲古菌素A（TSA）作用于膽管癌細(xì)胞系QBC939發(fā)現(xiàn)HDACI（TSA）通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)組蛋白去乙?；?，使細(xì)胞內(nèi)組蛋白過乙酰化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。已有超過80種HDACI應(yīng)用于臨床，可單用或者聯(lián)合其他化療一起使用，比較常用的HDAC藥物有伏立諾他、縮酚酞、MS-275[58]等。然而，在ICC中有關(guān)HDAC研究比較少。組蛋白修飾可能引起廣泛的基因表達(dá)譜差異并導(dǎo)致ICC易轉(zhuǎn)移以及出現(xiàn)廣泛的化療耐藥，其機(jī)制仍值得進(jìn)一步探索[52]。

4 ICC 的分子靶向治療

外科手術(shù)是當(dāng)前可能治愈ICC的唯一的方法，然而術(shù)后總體預(yù)后差。2017年版NCCN膽道系統(tǒng)惡性腫瘤指南指出：⑴ 對(duì)于可切除ICC，手術(shù)切除和淋巴結(jié)清掃是唯一可能的治愈手段。⑵ 對(duì)于不可切除者可予以氟嘧啶或吉西他濱為基礎(chǔ)的化療、局部區(qū)域療法（射頻消融術(shù)、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞、藥物洗脫微球動(dòng)脈化療栓塞和釔-90微球的肝動(dòng)脈放療性栓塞、肝動(dòng)脈輸注化療等綜合治療。⑶ 對(duì)于不可切除者，聯(lián)合吉西他濱+西妥昔單抗可獲得較好的療效[59]。對(duì)于ICC術(shù)后患者，目前仍沒有明確的最佳輔助治療策略與標(biāo)準(zhǔn)方案。

隨著對(duì)膽管癌分子機(jī)制的深入理解，人們開始關(guān)注ICC的分子靶向治療。生物靶向治療是針對(duì)特定的致癌位點(diǎn)（基因片段、抗原/受體或腫瘤微環(huán)境），通過設(shè)計(jì)相關(guān)的治療藥物進(jìn)入特定的致癌位點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不傷及正常組織或細(xì)胞的干預(yù)治療策略。臨床常用的靶向藥物主要以EGFR、VEGFR、PDE-FR、BRAF、MEK、mTOR、LI-6、COX-2等為作用靶點(diǎn)[60]。腫瘤基因靶向治療，主要有IDH1/IDH2抑制劑。選擇性IDH1抑制劑AGI-5198阻斷了這種酶產(chǎn)生代謝產(chǎn)物2-HG的能力，導(dǎo)致IDH1突變細(xì)胞的生長(zhǎng)受損[61]。同樣，選擇性突變IDH2抑制劑AGI-6780在造血細(xì)胞系中誘導(dǎo)分化[62]。IDH1突變的受試者進(jìn)行AG-120的晚期多中心，隨機(jī)，雙盲，安慰劑對(duì)照研究（NCT02989857），AG-221再IDH2突變的ICC實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中（NCT02273739）。腫瘤生物免疫靶向治療，主要包括：⑴ 以被動(dòng)免疫為主的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的單克隆抗體[63]。EGFR抗體（西妥昔單抗）和/或抗VEGF抗體(貝伐單抗)聯(lián)合臨床一線化療藥物取得了一定的療效；⑵ 以主動(dòng)免疫為主的激活的T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞疫苗、黏蛋白（mucin1，MUC1）的樹突狀細(xì)胞疫苗或膽管癌相關(guān)抗原Wilms腫瘤基因（Wilms' tumor gene，WT1）都取得了可喜的療效，患者副作用低，總體生存率提高[64]。針對(duì)腫瘤微環(huán)境炎癥因子的靶向治療，ICC的病理基礎(chǔ)是膽管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期受到慢性炎癥刺激，而其中扮演重要角色的炎癥因子是IL-6、COX-2[65]。塞來考昔是一種選擇性COX-2抑制劑，李勤裕等[66]研究了塞來考昔聯(lián)合EGFR酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939的作用，發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合可使癌細(xì)胞內(nèi)EGFR的下游分子p-MAPK下調(diào)，Ki-67、VEGFR的表達(dá)的降低，兩者具有協(xié)同作用，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制腫瘤新生血管形成。由于ICC癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因的突變或者多個(gè)信號(hào)通路的相互作用，目前對(duì)膽管癌的生物治療大多仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，臨床應(yīng)用較少。ICC存在基因變異的個(gè)體差異，進(jìn)展期膽管癌應(yīng)根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果實(shí)施個(gè)體化分子靶向治療[56]。

5 總結(jié)與展望

ICC形成、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程是一個(gè)多因素刺激、多個(gè)關(guān)鍵因子參與的過程。ICC手術(shù)治療和化療效果均不理想。盡管現(xiàn)階段腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)研究越來越深入，但是ICC發(fā)病的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制并不明確。表觀遺傳學(xué)研究提示基因遺傳變異、miRNA和組蛋白修飾的改變與ICC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，尋求ICC靶向治療可能成為治療ICC新的思路。未來新技術(shù)、新方法的運(yùn)用，找到引發(fā)ICC發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子并將其作為治療ICC的有效靶分子，或找出診斷ICC發(fā)生的關(guān)鍵因子一定為取得重大突破。將深刻改變未來ICC的治療模式。