右美托咪定對蛛網(wǎng)膜下腔出血患者早期腦損傷的影響▲

鐘日勝 秦東泉 冉雪蓮 梁樹聰 辜春霖

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院麻醉科，南寧市 530031，電子郵箱：2686510875@qq.com)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)是一種破壞性的腦血管疾病，有較高的死亡率和致殘率。SAH僅占腦卒中的5%，但其病死率占腦血管病死亡的25%[1-2]。SAH后72 h內可發(fā)生早期腦損傷，氧化應激和細胞凋亡是早期腦損傷的可能機制[3-5]。小膠質細胞由中樞神經(jīng)系統(tǒng)激活，可吞噬有害物質，但過度活化的小膠質細胞可釋放促炎細胞因子、趨化因子、氧化代謝物等加劇腦損傷[6-7]。此外，炎性細胞因子、趨化因子的釋放可進一步誘導循環(huán)免疫細胞的后續(xù)活化和浸潤，故消除炎癥的藥物可能是SAH患者麻醉的新策略[8]。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing protein 3,NLRP3)炎性體參與SAH后的炎癥反應，SAH后24 h NLRP3炎性體的表達顯著增加[9-10]。當NLRP3炎性體被激活時，促半胱氨酸蛋白酶-1轉化為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)，可促進白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18的釋放[11]。右美托咪定是一種高選擇性的α2受體，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，可在創(chuàng)傷性腦損傷和腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。本文探討右美托咪定通過下調NLRP3炎性小體的表達減輕SAH患者腦損傷的機制，為SAH患者麻醉劑的選擇提供理論和臨床基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年6月至2018年6月我院收治的80例SAH患者為研究對象，其中男39例，女41例，年齡(58.63±5.79)歲。入選標準：診斷符合我國腦血管病學術會議制定的蛛網(wǎng)膜下腔出血診斷標準[13]，并經(jīng)頭顱CT、CT血管成像、MRI血管成像、腦血管造影等檢查確診；研究對象及家屬均知情同意并簽署知情同意書；研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準。排除標準：患有心血管疾病史、心肌炎、急性心衰和胸部外傷者；肝臟、腎臟、肺臟等有嚴重炎癥和功能損傷者；糖尿病患者；血清肌酐濃度≥176.8 μmol/L；患有血液性或傳染性疾病者；無法耐受手術者。按隨機數(shù)字法將患者分為觀察組及對照組，每組40例。兩組患者性別、年齡、體重、發(fā)病至手術時間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法 兩組患者均在全麻下行顱內血腫清除術。采用靜-吸復合麻醉，麻醉誘導用靜脈注射維庫溴銨(荷蘭Organon公司，批號：1332285)0.1 mg/kg、芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)股份有限公司，批號：315023)2 μg/kg、丙泊酚(北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號：16LG8017)1 mg/kg；麻醉維持用異氟醚(1.5%～2%，美國雅培制藥有限公司，批號：07010，規(guī)格：100 ml)低流量持續(xù)吸入，用維庫溴銨2 mg/次間斷推注。切皮前給予5 μg舒芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，批號：1150309)靜脈推注。觀察組麻醉維持期間微量泵入右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：170211BC)，負荷量為1 μg/(kg·10 min)。

1.3 流式細胞術檢測腦脊液中小膠質細胞數(shù)量 分別于麻醉前和麻醉后30 min取腦脊液2 ml送檢。用40 μm尼龍細胞過濾器濾過腦脊液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌細胞，并在4℃下以2 000 r/min離心5 min,隨后將細胞重懸于5 ml 30%細胞分離液中離心10 min，加入異硫氰酸熒光素標記GSA同工酶B4混勻，室溫避光放置20 min。加入PBS 2 ml，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μl PBS重懸細胞。采用流式細胞儀檢測腦脊液小膠質細胞數(shù)量，以CellQuest軟件獲取細胞，分析細胞表面的平均熒光強度。

1.4 免疫印跡試驗檢測腦脊液NLRP3和Caspase-1水平 分別麻醉前后取腦脊液1 ml，采用全蛋白提取試劑盒(南京碧云天公司，批號：90090605)提取腦脊液樣品中的全蛋白，進行蛋白質印跡分析。取等量蛋白質樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在80 V下分離蛋白質30 min，然后將電壓升至120 V，持續(xù)60 min。電泳結束后，將蛋白質轉移到0.45 μm厚的硝酸纖維素膜上，然后在室溫下用脫脂乳封閉2 h。隨后，將膜分別置于鼠抗人NLRP3單克隆抗體(1 ∶1 000，南京碧云天公司，批號：15050403)、小鼠抗人Caspase-1單克隆抗體(1 ∶1 000，南京碧云天公司，批號：17088235)在4℃溫育過夜，檢測腦脊液NLRP3、Caspase-1表達水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清IL-1β、IL-18水平 分別于麻醉前后空腹抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心5 min，取血清4℃冰箱冷藏保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清IL-1β、IL-18水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自南京碧云天公司(IL-1β批號：16092549，IL-18批號：17090206)，嚴格按照產(chǎn)品說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者腦脊液小膠質細胞數(shù)比較 麻醉前，兩組患者腦脊液小膠質細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，麻醉后，兩組腦脊液內小膠質細胞少于麻醉前，且觀察組少于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 麻醉前后兩組患者腦脊液小膠質細胞計數(shù)比較(x±s，×105)

2.2 兩組血清IL-1β和IL-18水平比較 麻醉前，兩組血清IL-1β、IL-18水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，麻醉后，兩組IL-1β、IL-18水平均低于麻醉前，且觀察組低于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 麻醉前后兩組血清IL-1β、IL-18水平比較(x±s，ng/ml)

2.3 兩組麻醉前后腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達水平比較 麻醉前，兩組患者腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，麻醉后，兩組腦脊液NLRP3炎性體、Caspase-1表達量均低于麻醉前，并且觀察組低于對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 麻醉前后兩組患者腦脊液NLRP3、Caspase-1相對表達量比較(x±s)

3 討 論

SAH是指腦底部或腦表面的病變血管破裂，導致血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起而引發(fā)的一系列臨床綜合征。SHA早期腦損傷的發(fā)生機制可能為：神經(jīng)元發(fā)生免疫炎癥反應；腦細胞凋亡；血腦屏障損傷以及腦水腫；發(fā)生氧化應激反應等；一氧化氮合酶減少[14]。減輕SAH后早期腦損傷，促進神經(jīng)修復對提高患者生存率與生存質量具有重要意義。

右旋美托咪啶是一種高選擇性α2受體激動劑，可在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮多重保護作用，抗炎作用與其抗交感神經(jīng)活動有關[15]。研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪啶可以通過降低大鼠的體溫而減輕繼發(fā)性腦損傷，并可改善大鼠的神經(jīng)學評分[16]。右旋美托咪啶能夠抑制麻醉劑異氟醚對新生乳鼠的腦損傷[17-18]。本研究結果顯示，麻醉后，觀察組患者血清IL-1β、IL-18水平均低于麻醉前及對照組(均P<0.05)，提示右旋美托咪啶可抑制炎癥反應的擴增，從而阻止血腦屏障的破壞、細胞凋亡以及腦水腫的惡化[19-20]。本文結果還顯示，麻醉后，觀察組腦脊液內NLRP3炎性體、Caspase-1表達量均低于麻醉前及對照組(均P<0.05)，說明右美托咪定可通過阻斷NLRP3炎性體的激活從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。NLRP3炎性體影響機體的免疫防御系統(tǒng)，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，如急性肺損傷、痛風、糖尿病和動脈粥樣硬化。NLRP3炎性體的激活主要有以下兩個步驟[21]：(1)響應危險信號啟動NLRP3炎性體，危險信號包括與微生物感染相關的病原體相關分子模式和與無菌炎癥反應相關的損傷相關分子模式。(2)NLRP3炎性體的寡聚化和凋亡相關斑點樣蛋白的募集。有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-1的抑制降低了由脂多糖處理的RAW 264.7巨噬細胞激活的BV2小神經(jīng)膠質細胞中的IL-1β產(chǎn)生[22]。小膠質細胞是大腦的常駐免疫細胞，也是NLRP3炎性體的主要受體，當外界環(huán)境發(fā)生改變時，可被血液成分激活而發(fā)生遷移和吞噬作用，并可產(chǎn)生各種細胞因子和趨化因子，為受傷區(qū)域募集額外的外周免疫細胞。本研究結果發(fā)現(xiàn)，麻醉后觀察組患者腦脊液小膠質細胞數(shù)量少于麻醉前及對照組(均P<0.05)，提示右旋美托咪啶可以下調小膠質細胞數(shù)量，抑制或消耗小膠質細胞的激活，為腦損傷提供神經(jīng)保護作用，調節(jié)過度的炎癥反應，減輕腦水腫、血腦屏障破壞和細胞凋亡[17]。

綜上所述，右美托咪定可能通過抑制小膠質細胞的激活，抑制IL-β、IL-18的釋放及Caspase-1的轉化，下調NLRP3炎性體的表達，從而減輕SAH患者早期腦損傷。