CD2相關(guān)蛋白在腎臟疾病中的作用機(jī)制及相關(guān)研究進(jìn)展▲

梁勇華 劉運(yùn)廣 羅秀狀

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西百色市 533000，電子郵箱：710304325@qq.com；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣西百色市 533000)

【提要】 CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)是由CD2AP基因編碼產(chǎn)生的一種足細(xì)胞裂孔隔膜分子，是腎小球?yàn)V過屏障形成的重要蛋白分子，其在維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)以及生理功能中起至關(guān)重要的作用，多種腎臟疾病的發(fā)生與CD2AP表達(dá)密切相關(guān)。本文就近年來(lái)CD2AP的結(jié)構(gòu)分布、與腎臟疾病的關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行綜述。

CD2相關(guān)蛋白(CD2 associated protein，CD2AP)主要在腎臟的腎小球足細(xì)胞裂孔隔膜上表達(dá)，是保持腎小球?yàn)V過屏障生理完整性的重要組成成分[1]。CD2AP表達(dá)量的減少及結(jié)構(gòu)的變化可引起足細(xì)胞裂孔隔膜分子(slit diaphragm，SD)結(jié)構(gòu)的改變，并出現(xiàn)足細(xì)胞融合、足細(xì)胞從腎小球基底膜脫落，而成熟的足細(xì)胞沒有增殖能力，其發(fā)生損傷可能導(dǎo)致持續(xù)性不可逆性蛋白尿[2]，并逐漸出現(xiàn)腎功能衰竭甚至死亡[3-5]。有研究顯示，嘌呤霉素腎損害的小鼠足細(xì)胞CD2AP mRNA及其蛋白的表達(dá)量低于正常小鼠，提示CD2AP在腎病的發(fā)生中有重要的作用，而其具體作用機(jī)制目前尚未完全闡明。本文就CD2AP的結(jié)構(gòu)分布、與腎臟疾病的關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 CD2AP蛋白的結(jié)構(gòu)及分布

CD2AP蛋白是由位于6p12染色體上的CD2AP基因編碼，其編碼區(qū)長(zhǎng)為1920 bp，含有18個(gè)外顯子，由639個(gè)氨基酸組成，分子量約為70 kDa，其含有特殊的SH3結(jié)構(gòu)，在維持正常腎功能所需的細(xì)胞與細(xì)胞結(jié)合中發(fā)揮重要作用[6-7]。電子密度圖分析表明，CD2AP蛋白中央由卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成，形成四聚體的界面，周圍有四個(gè)對(duì)稱相關(guān)的圖案，每個(gè)圖案包含三個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)三個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域[8-10]，該結(jié)構(gòu)域由3個(gè)Src同源結(jié)構(gòu)域組成，鏈接在CD2AP的N端，為一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，但其氨基酸組成在少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)上存在差異，具有廣泛的分子靶點(diǎn)，能夠與分化抗原簇2(cluster of differentiation 2，CD2)、ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X，ALIX)、泛素連接酶(Casitas B-lineage lymphoma，c-Cbl)和泛素相互作用，具有分子識(shí)別和結(jié)合受體的功能；C端為一種螺旋式(亮氨酸-拉鏈)結(jié)構(gòu)域[11-13]。CD2AP的這種特殊構(gòu)成是其能使足細(xì)胞與不同分子之間發(fā)生相互作用并參與腎病發(fā)生的基礎(chǔ)。

CD2AP是由Dustin等[14]在小鼠身上發(fā)現(xiàn)，人類的CD2AP分子與小鼠非常相似，在人體內(nèi)CD2AP主要在腎小球的足細(xì)胞及 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)表面表達(dá)，在腦毛細(xì)血管、集合管、近端腎小管及遠(yuǎn)端腎小管細(xì)胞等也有少量表達(dá)[15]。

2 CD2AP與腎臟疾病的關(guān)系

CD2AP作為足細(xì)胞的重要蛋白之一，其特殊的SH3結(jié)構(gòu)使其可以與足細(xì)胞的其他蛋白分子如α-輔肌動(dòng)蛋白-4(a-actinin-4，ACTN4)、膜蛋白(Podocin)、足細(xì)胞裂孔隔膜特異蛋白(Nephrin)等相互作用，一起維持足細(xì)胞SD的正常形態(tài)和生理功能[16]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD2AP表達(dá)下降、缺失、損傷均會(huì)影響足細(xì)胞SD的生理功能，引起足細(xì)胞的細(xì)胞骨架破壞，影響濾過膜的通透性，從而出現(xiàn)大量蛋白尿[3-5]。而CD2AP基因剔除的小鼠在出生后約4周會(huì)出現(xiàn)腎衰竭和腎病綜合征，并在6周時(shí)死亡[3]。局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS)患者存在CD2AP突變，且激素耐藥型的FSGS患者可檢測(cè)出雜合CD2AP突變[17]。CD2AP純合子突變小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的腎病綜合征，伴有系膜細(xì)胞硬化，CD2AP單倍體功能不全的小鼠在9月齡時(shí)腎臟表現(xiàn)為系膜擴(kuò)張和高細(xì)胞性，將CD2AP基因轉(zhuǎn)入足細(xì)胞后可降低CD2AP純合子突變株的死亡率，提示CD2AP是腎足細(xì)胞功能的主要位點(diǎn)[4]。Tsvetkov等[18]對(duì)一名確診為FSGS且使用類固醇及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑抗蛋白治療6個(gè)月后病情反復(fù)的患者進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果顯示CD2AP中有一個(gè)雜合子p.t374a，c.1120a.g突變，突變位于CD2AP基因富含脯氨酸的編碼區(qū)域，組織學(xué)檢查也證實(shí)FSGS患者存在該突變。郝勝等[19]研究結(jié)果顯示，原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)患者腎組織CD2AP蛋白的表達(dá)低于正常健康者，且病理表現(xiàn)為FSGS的PNS患兒 CD2AP蛋白表達(dá)降低。史秀巖等[20]研究結(jié)果顯示，微小病變型腎病(minimal change disease,MCD)及膜性腎病(membranous nephropathy，MN)患者腎組織CD2AP蛋白表達(dá)量均低于健康對(duì)照組。Hyv?nen等[21]對(duì)2 251名Ⅰ型糖尿病患者CD2AP基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)CD2AP SNP rs9369717和rs9349417與終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)相關(guān)，CD2AP基因變異可能增加Ⅰ型糖尿病患者ESRD的易感性。在FSGS、MCD、MN、糖尿病腎病等患者中均發(fā)現(xiàn)CD2AP基因的突變及蛋白表達(dá)量的改變，提示CD2AP基因突變?yōu)槎喾N腎臟疾病的致病原因。

3 CD2AP在腎病中的相關(guān)分子機(jī)制

3.1 CD2AP參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為足細(xì)胞凋亡是腎小球硬化的標(biāo)志之一，是進(jìn)行性腎臟疾病發(fā)展的關(guān)鍵一步[22]，但足細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控尚不十分清楚。足細(xì)胞內(nèi)存在多種信號(hào)通路，磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)是一種抗凋亡、促生存的信號(hào)通路，活化胞內(nèi)PI-3K可使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP 3)水平升高并使Akt磷酸化，而Akt的激活在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝調(diào)控中起重要作用[23]。在嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)腎損傷模型中，CD2AP基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，使CD2AP蛋白表達(dá)下降，分布異常，PI3K/Akt信號(hào)途徑不能激活，絲氨酸蛋白激酶(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)磷酸化也被抑制，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[23-25]。此外，CD2AP蛋白還可調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)/EGFR、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)/p38等通路。Ha等[24]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者腎臟高葡萄糖和晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-product，AGE)能降低腎臟組織CD2AP蛋白和mRNA的表達(dá)，PI3K抑制劑能阻止高糖和AGE誘導(dǎo)的CD2AP蛋白在濾過膜的含量和分布的變化，提示糖尿病患者PI3K/Akt信號(hào)通路可誘導(dǎo)足細(xì)胞CD2AP蛋白的表型發(fā)生改變，從而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡等過程。TGF-β被認(rèn)為是足細(xì)胞損傷的中心介質(zhì)，隨著自分泌和旁分泌的激活，TGF-β在腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)的信號(hào)級(jí)聯(lián)被認(rèn)為是所有慢性腎臟疾病(chronic kidney diseases，CKDs)的標(biāo)志[26]。TGF-β可經(jīng)Smad途徑介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，同時(shí)亦可激活 PI3K/AKT途徑，而后者需要足細(xì)胞CD2AP蛋白的參與[27]。研究發(fā)現(xiàn)，CD2AP可使樹突蛋白轉(zhuǎn)移至胞核，而樹突蛋白可使胞漿組織蛋白酶L(Cathepsin L，Cat L)的表達(dá)增強(qiáng)，CD2AP可被Cat L蛋白水解，在足細(xì)胞損傷時(shí)促進(jìn)蛋白酶的持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而增加TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的敏感性[23，26]。有研究顯示，糖尿病腎病患者血流動(dòng)力學(xué)和代謝的變化與腎小球系膜中TGF-β1表達(dá)的增加和細(xì)胞外基質(zhì)的擴(kuò)張以及足細(xì)胞數(shù)量的減少相關(guān)[28]。

3.2 CD2AP參與細(xì)胞間的黏附及遷移 肌動(dòng)蛋白以多種方式參與細(xì)胞的黏附并維持上皮屏障功能的穩(wěn)定。肌動(dòng)蛋白不僅可以通過聚集膜黏附分子參與質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域的形成過程，它還能通過細(xì)胞黏附分子的黏附作用穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的正常結(jié)構(gòu)。同時(shí)，肌動(dòng)蛋白還參與細(xì)胞接觸部位的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，而CD2AP蛋白是維持肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定性所必需的物質(zhì)。CD2AP與穩(wěn)定的肌動(dòng)蛋白池和ACTN4蛋白共同定位于細(xì)胞間黏附處，抑制肌動(dòng)蛋白絲倒刺樣末端結(jié)構(gòu)的動(dòng)力作用，剔除CD2AP基因可使細(xì)胞黏附處的肌動(dòng)蛋白減少，黏合強(qiáng)度降低，導(dǎo)致細(xì)胞之間的鏈接撕裂，屏障功能破壞[29]。因此，CD2AP不僅能增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附作用，使上皮細(xì)胞適應(yīng)機(jī)械應(yīng)力，還可增加肌動(dòng)蛋白的積累和維持細(xì)胞黏附連接的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，CD2AP可將肌動(dòng)蛋白的加帽蛋白(capping protein，CP)招募到細(xì)胞邊緣，靠近肌動(dòng)蛋白絲有刺的末端并被CP覆蓋，CD2AP的缺失導(dǎo)致CP不能正常向細(xì)胞邊緣聚集，細(xì)胞周邊肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)力減弱[30-31]。

白細(xì)胞黏附、爬行和遷移是通過內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械感受器細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的聚集來(lái)調(diào)節(jié)的。Schaefer等[32]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中CD2AP可與ICAM-1相互作用，這種相互作用介導(dǎo)ICAM-1的機(jī)械信號(hào)傳遞，并推動(dòng)皮層肌動(dòng)蛋白(cortactin)和纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)向黏附復(fù)合物募集；此外，CD2AP與聚集的ICAM-1結(jié)合是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)相關(guān)C3型肉毒毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Racl)的招募和激活所必需的；相反，Racl的活性限制了CD2AP-ICAM-1的相互作用；CD2AP是ICAM-1聚集的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可限制ICAM-1黏附復(fù)合物的形成，阻止中性粒細(xì)胞無(wú)控制的黏附和細(xì)胞間的遷移。因此，CD2AP對(duì)ICAM-1起負(fù)調(diào)節(jié)作用，這為CD2AP在腎病中的炎癥反應(yīng)提供了新的理論機(jī)制。

3.3 CD2AP與其他相關(guān)蛋白的相互作用 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腎病蛋白、CD2AP、ACTN4、突觸連接蛋白、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白等足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子是足細(xì)胞裂孔膜的重要組成部分，共同維持著腎小球的正常生理功能[33-34]。CD2AP的三個(gè)SH3使其不僅可與足細(xì)胞裂隙膜蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，還可以與腎病蛋白相結(jié)合形成復(fù)合物，共同構(gòu)成足細(xì)胞的骨架，維持濾過膜的濾過功能。 腎病蛋白和CD2AP通過與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基相互作用，激活PI3K/AKT，共同參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15，24]。有研究發(fā)現(xiàn)P85、 CD2AP、腎病蛋白可以發(fā)生免疫共沉淀，并形成腎病蛋白-CD2AP-P85復(fù)合物， CD2AP的SH3結(jié)構(gòu)介導(dǎo)該復(fù)合物的形成[35-37]。在小鼠的動(dòng)物模型中剔除小鼠CD2AP基因后，腎病蛋白基因表達(dá)減少，足細(xì)胞裂隙膜蛋白基因表達(dá)增加；剔除足細(xì)胞裂隙膜蛋白基因后，腎病蛋白基因表達(dá)減少，CD2AP基因表達(dá)增加；剔除腎病蛋白基因時(shí)，CD2AP基因表達(dá)增加，而足細(xì)胞裂隙膜蛋白基因表達(dá)不變[38]，提示三者間的關(guān)系密不可分，CD2AP基因可能發(fā)揮更加重要的作用。

接頭蛋白85(Cbl-interacting protein of 85 kDa，CIN85)與CD2AP均屬于適配蛋白家族中的一員，兩者的序列和結(jié)構(gòu)有高度的相似性，他們都包含三個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，一個(gè)脯氨酸豐富區(qū)和一個(gè)盤繞結(jié)構(gòu)域[39-41]。在CD2AP基因完全剔除(CD2AP-/-)的小鼠中足細(xì)胞的CIN85表達(dá)增強(qiáng)，而在無(wú)CD2AP基因缺失(CD2AP+/+)的小鼠其足細(xì)胞CIN85的表達(dá)明顯減少，而且在CD2AP存在時(shí)，小泛素相關(guān)修飾因子對(duì)CIN85的類泛素化作用增強(qiáng)，CIN85與nephrin的結(jié)合增加[39]，這種調(diào)節(jié)共同維持狹縫隔膜分子的縫隙膜穩(wěn)定性。CIN85和CD2AP的SH3結(jié)構(gòu)域可相互作用，并通過激活配體參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)受體的內(nèi)吞過程，CIN 85和CD2AP還可參與大麻素受體1介導(dǎo)的多種受體酪氨酸激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12，40]。

支架蛋白抗原1(Ras GTPase-activating-like protein，IQGAP1)是鏈接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與裂隙隔膜蛋白的支架蛋白，參與足細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，影響足細(xì)胞的通透性[42]。IQGAP1與足細(xì)胞縫隙隔膜內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)如nephrin、膜相關(guān)鳥苷酸激酶1抗體(The membrane-associated guanylate kinase with inverted，MAGI-1)、 CD2AP、 podocin、酪氨酸激酶銜接蛋白1/2(Recombinant Non Catalytic Region Of Tyrosine Kinase Adaptor Protein 1/2,NCK1/2)、ACTN4、 β連環(huán)蛋白(β-catenin)蛋白相互作用[43]，共同參與細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)，并且可連接細(xì)胞骨架與狹縫隔膜復(fù)合體，IQGAP1表達(dá)下調(diào)可降低足細(xì)胞的遷移，增加足細(xì)胞層的通透性，這在腎小球疾病的病理生理中具有重要意義。

4 小 結(jié)

目前已有大量研究表明CD2AP與腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)的減弱或缺失均可導(dǎo)致腎病，但其在腎病中的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，了解CD2AP基因及其相關(guān)蛋白在腎病中的作用機(jī)制，有助于疾病的診斷及預(yù)后的判斷，也為治療方案的選擇提供指導(dǎo)意見。